LSECtin在HBV感染小鼠模型中的免疫功能研究.pdf

1、肝臟作為免疫器官，承擔著耐受和免疫的雙重功能。兩者間的精妙平衡依賴于肝內定居的各種免疫細胞和外周白細胞之間的復雜相互作用網(wǎng)絡。長期以來，盡管肝臟免疫耐受（肝移植）和免疫低反應性（病毒慢性感染）早已被公認，但具體的機制還很不清楚。該屬性使得肝臟成為病原體的靶器官，一些病原體如HBV則逃脫免疫控制而在肝細胞長期存在。
　　HBV是嗜肝性DNA病毒。HBV感染導致慢性肝炎，肝硬化和肝細胞癌，是威脅到人類健康的世界性衛(wèi)生問題。就病毒本身而

2、言，對肝細胞并無直接的病變作用。其對肝臟的巨大損傷來之病毒慢性感染誘導的免疫反應，由早期的應答不充分到中期的衰竭及后期的免疫紊亂。因此，機體針對病毒的免疫反應被認為是引起肝臟疾病的重要原因。而同時機體針對病毒的免疫反應也完全介導了病毒的清除。免疫反應的雙刃劍角色，讓我們干預處理慢性感染時，尋找合適的平衡點，就顯得尤為重要。
　　HBV感染后，積極有效的清除病毒，依賴于天然免疫和繼發(fā)免疫的共同調節(jié)作用。在CD4+T細胞的輔助下，CD

3、8+T細胞通過細胞毒和非細胞毒機制，清除感染的靶細胞。因此，CD8+T細胞的功能和狀態(tài)在決定病毒感染的進程上起著決定性的作用。很遺憾的是，慢性感染時，CD8+T細胞常常處于衰竭狀態(tài)。當前的研究發(fā)現(xiàn)了多種與之相關免疫信號轉導通路。包括細胞膜表面高表達以PD-1為代表的多種抑制性受體，這些負調控分子限制了T細胞抗病毒效應;其次，在微環(huán)境下，其它細胞分泌的調節(jié)性因子，如IL-10，TGF-β調節(jié)和抑制抗病毒免疫反應;第三，調節(jié)性細胞，如Fox

4、P3+的天然和誘導的調節(jié)性細胞(Tregs)、調節(jié)性CD8+T細胞和髓來源抑制細胞，以cell-to-cell的接觸方式，抑制APC的成熟、分泌調節(jié)性細胞因子和直接減弱T細胞的功能;最后，職業(yè)和非職業(yè)抗原遞呈細胞的改變給予T細胞的不適當刺激信號。由細胞和分子構成的綜合體系，編織了一套復雜的抑制性網(wǎng)絡，抑制CD8+T細胞的抗病毒功能，從而促進病毒的持續(xù)性感染。
　　當前，治療乙肝，日益被國際認可的趨勢是:雙管齊下，聯(lián)合治療。既要抗病

5、毒，又要調免疫。僅抑制病毒復制無法恢復受損的免疫系統(tǒng)。降低病毒載量，提升免疫能力，打破免疫耐受，以恢復患者的抗病毒免疫應答，最終達到持久清除病毒、恢復機體保護性免疫。目前免疫調節(jié)藥物有DC疫苗療法，CIK細胞療法和免疫負調節(jié)分子（PD-1，IL-10，LAG-3，TIM-3等）阻斷法。HBV特異性T細胞功能受損是機體無法清除病原體的關鍵原因之一，而免疫負調節(jié)分子又是促使T細胞功能衰竭的關鍵因素，因此以T細胞免疫負調節(jié)分子為靶標，封閉其抑

6、制功能從而恢復T細胞的免疫反應，尤其是起關鍵效應功能的CD8+T細胞，重獲抗病毒能力。
　　LSECtin是Ⅱ型跨膜糖蛋白，位于人類染色體19p13.3，是C型凝集素家族的新成員，該家族成員包括CD23、DC-SIGN、DC-SIGNR。LSECtin結合Ebola病毒，SARS冠狀病毒，纖絲病毒，Lassa病毒，促進細胞對日本腦炎病毒的易感性。我們實驗室的前期研究結果表明LSECtin以Ca2+依賴的方式，結合活化的T細胞表面的

7、N-鏈接的糖蛋白，抑制T細胞的增殖，降低T細胞分泌IFN-γ，IL-2的水平，從而負調節(jié)T細胞的免疫應答。這促使我們想知道LSECtin在HBV感染時的免疫調節(jié)功能。
　　我們計劃構建HBV急性感染，慢性感染小鼠模型。在模型小鼠里，我們通過過表達LSECtin蛋白和敲除LSECtin，以及封閉LSECtin等手段，多層次多角度探索LSECtin在HBV感染時的免疫功能。
　　由于HBV感染宿主的偏嗜性:人和猩猩，以及HBV轉

8、基因小鼠的天生中樞耐受，長期以來限制了在小動物模型上研究HBV導致的免疫反應。直到近年來， Francis V.Chisari團隊和臺灣陳培哲團隊分別首次建立了HBV急性感染和慢性感染小鼠模型。為研究HBV提供了強有力的工具。我們嘗試建立該模型，通過劑量優(yōu)化，檢測體系和評價體系摸索，我們成功的建立了HBV急性感染的小鼠模型，可持續(xù)2周左右;同時，我們還建立抗原持續(xù)時間更長一些的急性感染模型，抗原的持續(xù)時間可達1個月。最后，我們建立了慢性

9、感染模型，滿一年后，仍有1/3的小鼠，表面抗原為陽性。
　　首先，我們在Balb/c背景的LSECtin敲除小鼠里建立兩種急性模型，缺失LSECtin后，血清中表面抗原和E抗原的水平更低，肝細胞中核心抗原下降，表面抗原的陽性率更低。反之，我們利用質粒在小鼠體內過表達LSECtin，則延緩病毒抗原清除。在C57BL/6背景的慢性模型中，敲除LSECtin，加速抗原的清除，小鼠有更低的表面抗原陽性率，這和急性模型的表型一致。總之，LS

10、ECtin可以延緩病毒抗原的清除，動物表型提示LSECtin可能是病毒持續(xù)感染的“幫兇”。
　　LSECtin是通過什么機制延緩病毒抗原清除的呢？LSECtin作為繼發(fā)免疫的負調控分子，減弱繼發(fā)免疫反應，結合活化的T細胞，抑制T細胞的增殖，降低T細胞分泌IFN-γ和IL-2的水平。而CD8+T細胞在決定病毒感染的發(fā)生發(fā)展有至關重要的作用。于是，我們探討LSECtin是否抑制了CD8+T細胞的抗病毒功能。建模后，比較WT和KO小鼠肝

11、臟淋巴細胞中CD8+T細胞的表型，我們發(fā)現(xiàn)，缺失LSECtin后，CD8+T細胞呈現(xiàn)CD25high CD62LlowCD127low的表型，而這群細胞正是發(fā)揮抗病毒效應的細胞。提示LSECtin可能抑制CD8+T細胞的活化及效應。進一步的ELISpot實驗，也提示LSECtin抑制病毒特異性T細胞分泌IFN-γ的能力，肝臟混合淋巴細胞中CD8+T細胞是分泌抗病毒關鍵因子IFN-γ的主要來源?？傊w內外實驗，提示LSECtin可能通過

12、降低表型為CD25high CD62LlowCD1271ow的CD8+T細胞群比例，抑制肝臟內淋巴細胞分泌效應因子IFN-γ的能力，從而導致延緩病毒抗原清除。
　　在表型確鑿和機制上有初步探討后，我們想在應用有所嘗試。小分子化合物GlcNAcβ1-2Man是LSECtin的高親和力配基。Ki值為3.5±0.4μM。近期研究發(fā)現(xiàn)，GlcNAcβ1-2Man可阻斷LSECtin與Ebola病毒，Lassa病毒等病毒的相互結合，此外，該

13、化合物還可封閉LSECtin對日本腦炎病毒的識別，降低細胞的易感性。但是，GlcNAcβ1-2Man在體內是否有封閉功能，國際上未有報道。我們建立HBV慢性感染小鼠模型，腹腔注射13μM的GlcNAcβ1-2Man，持續(xù)六周，令人吃驚的是，糖注射組比PBS組有更低的表面抗原和E抗原水平，表面抗原陽性率更低，暗示GlcNAcβ1-2Man可作為LSECtin的功能性阻斷劑。
　　綜上所述，LSECtin作為免疫負調控分子，抑制CD8