CUEDC2在腎間質(zhì)纖維化中的作用及機制研究.pdf

1、本實驗主要是通過建立纖維化模型來探討CUEDC2在腎纖維化中的作用及其可能的機制。
　　（一）CUEDC2蛋白對單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)小鼠腎組織炎癥反應(yīng)的作用
　　目的:研究CUEDC2蛋白在單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎組織炎癥反應(yīng)中的作用。
　　方法:建立單側(cè)輸尿管梗阻模型:清潔級balb/c小鼠30只（購自中山大學醫(yī)學實驗動物中心），將小鼠隨機分為假手術(shù)組(sham-vector)、UUO組(uuo-vector)、CU

2、EDC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染治療組(uuo-cuedc2)，每組分別有10只小鼠。UUO組及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染治療組均行單側(cè)輸尿管梗阻手術(shù)，即將右側(cè)輸尿管進行游離并結(jié)扎離斷，而假手術(shù)組只游離右側(cè)輸尿管，不進行結(jié)扎離斷。采用超聲微泡聯(lián)合穿膜肽技術(shù)分別在術(shù)前1天、術(shù)后1天及術(shù)后7天給三組動物實驗小鼠進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，假手術(shù)組和UUO組轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒，治療組轉(zhuǎn)染cuedc2質(zhì)粒。質(zhì)粒均經(jīng)由尾靜脈注入。于術(shù)后第7天和第14天分別處死小鼠，每組5只。留取組織標本時，采集各組

3、小鼠血液，離心吸取上清，-80℃保存?zhèn)溆?。灌流沖洗，待腎臟變白后小心剝離右側(cè)腎臟，去除包膜，將腎組織分為不同小塊，留做免疫組化或用于提取組織蛋白。采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測炎癥因子細胞間黏附分子-1（ICAM-1，intercellular cell adhesion molecule1）、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1，monocyte chemotactic protein1)、白介素-1（IL-1）、白介素-8(IL-

4、8)表達;免疫組織化學法檢測腎組織單核/巨噬細胞表面抗原(CD68)及腎臟組織中CUEDC2蛋白的表達;
　　結(jié)果:CUEDC2免疫組化結(jié)果顯示，UUO術(shù)后CUEDC2蛋白表達減少，經(jīng)過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，其表達增加(p＜0.05)。ELISA及CD68抗原免疫組化結(jié)果顯示，UUO模型組，炎癥因子ICAM1、MCP1、IL1、IL8及CD68抗原表達增加，隨梗阻時間延長，增多趨勢更加明顯(p＜0.05);治療組中炎癥因子表達和CD68抗原

5、表達下調(diào)，在各時間點均低于UUO組的表達。
　　小結(jié):CUEDC2蛋白可以抑制單核/巨噬細胞浸潤、減少炎癥因子在纖維化腎組織中的表達，減輕腎臟炎癥反應(yīng)，進而可以抑制腎臟纖維化的發(fā)生。
　　（二）CUEDC2在腎間質(zhì)纖維化中的作用及其可能機制
　　(1)體外細胞實驗
　　目的:探討CUEDC2蛋白在腎小管上皮細胞（HK2細胞）EMT中的作用及可能機制。
　　方法:5ng/ml TGF-β1刺激HK2細胞，共6

6、個時間點，誘導其EMT模型形成。用試劑盒提取vector和cuedc2目標質(zhì)粒，制備慢病毒，用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法構(gòu)建穩(wěn)定過表達目標質(zhì)粒的HK2細胞系，之后同樣用TGF-β1來刺激細胞，調(diào)整為刺激4個時間點。Western免疫印跡檢測CUEDC2、Fibronectin、E-cadherin、Vimentin、p-smad2、p-smad3和smad2、smad3蛋白的表達。
　　結(jié)果:TGF-β1刺激HK2細胞，使其E-cadherin

7、蛋白表達下調(diào)，F(xiàn)ibronectin蛋白表達上調(diào)，隨刺激時間延長，這種變化趨勢愈加明顯，表明TGF-β誘導的EMT模型已經(jīng)成功建立，此時，CUEDC2蛋白隨梗阻時間延長，表達量逐漸下調(diào)。TGF-β1分別刺激過表達vector及cuedc2的HK2細胞，CUEDC2蛋白表達在穩(wěn)定過表達組較對照組明顯增加，表明穩(wěn)定過表達細胞系構(gòu)建成功。此時，與對照組相比，CUEDC2穩(wěn)定過表達組中，在刺激的各時間點，E-cadherin蛋白表達增加，F(xiàn)ib

8、ronectin、Vimentin蛋白表達下降，p-smad2和p-smad3蛋白表達減少。
　　小結(jié):CUEDC2蛋白在TGF-β誘導的EMT中表達下調(diào)，過表達CUEDC2可以減少間質(zhì)表型蛋白表達，增加上皮表型蛋白表達，抑制smad2和smad3蛋白的磷酸化表達，抑制TGF-β1誘導的EMT，CUEDC2可能參與了EMT的負性調(diào)節(jié)過程。
　　(2)體內(nèi)實驗
　　目的:探討CUEDC2蛋白在梗阻性腎病對間質(zhì)纖維化的影響

9、及其可能的機制。
　　方法:UUO模型建立及組織標本收集，同上。HE及Masson染色觀察腎臟病理改變，Western Blot用于檢測腎組織中CUEDC2、Fibronectin、E-cadherin、p-smad2、p-smad3等蛋白的表達。
　　結(jié)果:CUEDC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染治療組，UUO術(shù)后7d及14d，腎組織的小管變性壞死程度、間質(zhì)炎細胞浸潤和纖維化改變程度較UUO組明顯減輕，腎間質(zhì)的藍染面積與UUO組相比顯著降低。

10、經(jīng)CUEDC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染治療后，CUEDC2蛋白表達上調(diào)，E-cadherin蛋白表達量增加，F(xiàn)ibronectin、CollagenⅠ、p-smad2、p-smad3蛋白表達量降低。
　　小結(jié):CUEDC2在UUO腎纖維化中，可以減輕腎小管損害程度，減少間質(zhì)膠原的沉積，抑制細胞外基質(zhì)合成，抑制p-smad2和p-smad3蛋白的表達，抑制腎間質(zhì)纖維化。
　　結(jié)論:CUEDC2蛋白在細胞EMT模型和動物UUO模型中均表達下調(diào)，