siRNA逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的體內(nèi)外研究.pdf

1、背景與目的：惡性腫瘤產(chǎn)生的多藥耐(multidrug-resistance，MDR)已成為當(dāng)前影響腫瘤化學(xué)治療療效的主要障礙。多藥耐藥性是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生抗藥性的同時(shí)，對(duì)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的多種抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉抗藥性，從而大大降低了抗腫瘤藥物的療效。MDR產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜，其中由MDR1基因編碼的P-gp(P-glycoprotein，P-gP)的過(guò)度表達(dá)是產(chǎn)生MDR的主要原因。RNAi (RNA interference，

2、RNAi)是近年來(lái)興起的一種基因技術(shù)，指在廣泛的生物范圍內(nèi)都存在的由dsRNA(double stranded RNA，dsRNA)介導(dǎo)的同源基因表達(dá)受抑制的現(xiàn)象，使內(nèi)源性mRNA發(fā)生特異性降解，代替了傳統(tǒng)反義核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因沉默。本研究探討體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)后對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和裸鼠人肺癌移植瘤的多藥耐藥性的影響。 方法：在GeneBank中找出人多藥

3、耐藥基因的mRNA序列，利用Invitrogen公司的RNA在線工具，設(shè)計(jì)了2對(duì)靶向多藥耐藥基因(MDR1)的干擾序列MDR1siRNAs和1對(duì)非特異siRNA，并進(jìn)行Blast比對(duì)排除同源性。利用化學(xué)合成法得到干擾序列，體外與陽(yáng)離子脂質(zhì)體構(gòu)建轉(zhuǎn)染復(fù)合體，轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞株，然后在轉(zhuǎn)染后24 h和48 h采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)和Western blot檢測(cè)細(xì)胞中MDR1 m

4、RNA和P-gp蛋白的表達(dá)情況，為了檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥情況，我們將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞與臨床常用的耐藥的化療藥物進(jìn)行共培養(yǎng)，然后采用MTT法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算抑制率(inhibition rate，IR)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100％；為了進(jìn)一步探討MDR1siRNA的體內(nèi)干擾效果，我們構(gòu)建了裸鼠人肺癌移植瘤模型，聯(lián)合運(yùn)用活體電穿孔和瘤內(nèi)注射轉(zhuǎn)染技術(shù)，將MDRlsiRNA轉(zhuǎn)染入移植瘤內(nèi)，并設(shè)計(jì)了不同的轉(zhuǎn)染劑量組(0

5、.5nmol/150mm<'3>、1nmol/150mm<'3>、2nmol/150mm<'3>、3nmol/150mm<'3>)，在轉(zhuǎn)染后48 h提取瘤組織，RT-PCR和immunohistochemistry檢測(cè)腫瘤中MDR1 mRNA和P-gp的表達(dá)情況；為了進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)染MDR1siRNA后，腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥情況，我們?cè)谵D(zhuǎn)染后48 h開(kāi)始腹腔注射給予裸鼠抗腫瘤藥物長(zhǎng)春瑞濱(Vinorelbine Bitartrate， N

6、VB)治療(5mg/kg/w)，轉(zhuǎn)染后每?jī)商鞙y(cè)量一次腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑，根據(jù)公式V=лab<'2>/6計(jì)算腫瘤的體積，繪制出腫瘤的生長(zhǎng)曲線，并在最后一次給藥后2天，處死裸鼠，取出瘤塊進(jìn)行稱重，然后根據(jù)公式IR=(1-實(shí)驗(yàn)組的平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)×100％計(jì)算抑瘤率。 結(jié)果：細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染MDR1siRNA后，RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示MDR1 mRNA和P-gp的表達(dá)較未轉(zhuǎn)染組明顯下降，藥敏結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染

7、MDR1siRNA后，逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿(Vincristine，VCR)、卡莫斯汀(Becenun，BCNU)、司莫司汀(Me-CCN)的耐藥(IR>30％)，增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)紫杉醇(Pacilitaxel，PTX)、表柔比星(Epimbicin，EPI)的敏感性(IR>50％)；裸鼠人移植瘤內(nèi)轉(zhuǎn)染MDR1 siRNA后，RT-PCR和immunohistochemistry結(jié)果顯示低劑量轉(zhuǎn)染時(shí)僅能輕度抑制腫瘤中MDR1mRNA和P-g

8、p的表達(dá)，隨著轉(zhuǎn)染劑量的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)，至2nmol/150mm<'3>時(shí)，抑制作用達(dá)到最大，當(dāng)繼續(xù)增加劑量時(shí)，表達(dá)未見(jiàn)繼續(xù)降低，說(shuō)明活體轉(zhuǎn)染MDR1siRNA后能有效抑制MDR1mRNA和P-gp的表達(dá)，且其抑制作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。同時(shí)瘤內(nèi)轉(zhuǎn)染MDR1siRNA后給予NVB(5mg/kg/w，i.p.)，結(jié)果顯示腫瘤的生長(zhǎng)顯著減慢，NVB的抑瘤率明顯提高，而對(duì)未轉(zhuǎn)染MDR1siRNA的腫瘤的生長(zhǎng)沒(méi)有表現(xiàn)出明顯抑制，說(shuō)明