聯(lián)體共生小鼠模型中肝細(xì)胞衰老逆轉(zhuǎn)的研究.pdf

1、細(xì)胞衰老是指在DNA損傷、端粒酶活性丟失等內(nèi)在因素和細(xì)胞間通訊改變、體液循環(huán)因子改變等外在條件的刺激下，細(xì)胞發(fā)生一系列形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致細(xì)胞永久性退出分裂周期，無法發(fā)揮正常生理功能。而衰老細(xì)胞的累積會導(dǎo)致組織器官的衰老，進(jìn)而引發(fā)組織器官衰老問題，如機(jī)體的結(jié)構(gòu)和功能異常和各種衰老相關(guān)疾病的發(fā)生。
　　肝臟是一個以代謝為核心功能的器官，而肝細(xì)胞是肝臟組織中最主要的實質(zhì)細(xì)胞。膽汁合成、肝糖貯存、脂質(zhì)代謝等多種肝功能都是由肝細(xì)胞來承擔(dān)的

2、。隨著年齡增長，老年肝臟肝細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了一系變化，比如肝細(xì)胞體積變大，數(shù)量減少、增殖能力降低、肝細(xì)胞核出現(xiàn)空泡，胞質(zhì)出現(xiàn)脂褐素沉積、DNA含量異常，巨核肝細(xì)胞比例升高等。然而，由于衰老肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)改變和功能異常，導(dǎo)致老年個體更容易發(fā)生各種肝臟疾病。比如老年個體容易出現(xiàn)肝臟脂肪性病變，老年小鼠中應(yīng)對CCl4等化學(xué)藥物的能力下降，肝臟的炎癥水平升高，加速肝臟纖維化病癥的發(fā)生發(fā)展。由此可見，肝細(xì)胞衰老與肝臟疾病發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。

3、因此，探尋肝細(xì)胞衰老逆轉(zhuǎn)的途徑是老年肝臟疾病治療的必然要求。然而由于肝臟衰老模型小鼠缺乏等各種困難，目前仍無法獲得肝細(xì)胞衰老逆轉(zhuǎn)的深入研究。
　　本項目研究中，基于聯(lián)體共生模型，使得聯(lián)體的兩只小鼠可以共享彼此的血液微環(huán)境途徑而用來探討微環(huán)境對肝細(xì)胞衰老逆轉(zhuǎn)的作用。首先，分別建立了2月齡和24月齡小鼠間聯(lián)體（聯(lián)體的2月齡為Het-Y，聯(lián)體的24月齡小鼠為Het-O）、相同月齡的年輕小鼠間聯(lián)體(聯(lián)體的同月齡小鼠都稱為Iso-Y)和相同

4、月齡的老年小鼠間聯(lián)體(聯(lián)體的老年小鼠都稱為Iso-O)3種聯(lián)體共生模型。通過流式分析結(jié)果顯示聯(lián)體小鼠間血液交換率接近50％。成功構(gòu)建聯(lián)體共生模型后，使得聯(lián)體小鼠共同生活5周，然后分別對不同組聯(lián)體小鼠肝臟肝細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特征和肝細(xì)胞功能的分析，評價年輕微環(huán)境對衰老肝細(xì)胞逆轉(zhuǎn)的作用。細(xì)胞衰老相關(guān)指標(biāo)的檢測結(jié)果顯示，在年輕血液微環(huán)境的作用下，與Iso-O小鼠相比，老年小鼠SA-β-gal陽性率從38.23％±1.86％降低到4.84％±0.7

5、1％;γ-H2A.X陽性率從53.98％±3.78％降低到15.46％±1.86％;衰老指標(biāo)細(xì)胞周期抑制因子P53、P21和P16的表達(dá)明顯降低(p＜0.01);炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-8的表達(dá)水平也降低(p＜0.01)。其次，老年小鼠肝臟多倍體肝細(xì)胞數(shù)量增加，而多倍體肝細(xì)胞發(fā)生衰老的可能性增加。通過肝細(xì)胞比例分析發(fā)現(xiàn)，在年輕微環(huán)境的作用下，與Iso-O相比，老年小鼠八倍體肝細(xì)胞比例從33.35％±0.85％降低到15.97

6、％±0.84％;二倍體肝細(xì)胞比例從7.41％±0.54％升高到27.27％±0.71％。進(jìn)一步對肝細(xì)胞數(shù)目和大小進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在年輕微環(huán)境作用下，相同視野范圍內(nèi)，老年肝臟肝細(xì)胞數(shù)目從402±18個增加到617±42個，細(xì)胞面積也從645.99±32.72μm2減小至356.93±22.33μm2。前期的研究表明隨著年齡的增加肝細(xì)胞增殖能力降低，體現(xiàn)在小鼠肝臟肝切后肝臟再生能力減弱和衰老肝細(xì)胞移植后再殖能力的下降。然而老年小鼠在年輕

7、小鼠血液的影響下，其增殖能力發(fā)生了明顯變化。原位肝組織增殖能力檢測和原代肝細(xì)胞體外短期培養(yǎng)結(jié)果都顯示，年輕微環(huán)境作用下，衰老肝細(xì)胞增殖能力得到恢復(fù)，增殖水平與年輕小鼠相類似。上述結(jié)果證實:在年輕微環(huán)境作用下，衰老肝細(xì)胞的衰老指標(biāo)消失了，衰老肝細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)發(fā)生了衰老逆轉(zhuǎn)，且重新獲得了類似年輕肝細(xì)胞的增殖潛能。
　　衰老肝細(xì)胞發(fā)生系列形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的改變，導(dǎo)致其對外界刺激的耐受力下降，因而慢性肝炎、肝纖維化、肝癌等肝臟疾病在老年個

8、體中發(fā)生機(jī)會增加。隨著年齡的增長，衰老肝細(xì)胞出現(xiàn)脂質(zhì)代謝障礙，肝臟內(nèi)脂肪累積的水平提高，老年肝臟脂肪病變的發(fā)生幾率明顯增加。在聯(lián)體共生模型中，發(fā)現(xiàn)老年小鼠在年輕血液微環(huán)境的調(diào)控下，老年肝臟脂肪累積程度得到明顯的緩解。肝臟脂滴原位染色結(jié)果顯示，年輕微環(huán)境的作用下，于Iso-O相比較，油紅O的陽性面積從24.01％±3.48％降低到4.15％±2.95％，且尼羅紅的陽性面積也降低4倍。血清學(xué)指標(biāo)也顯示老年小鼠TG、膽固醇和LDL-c水平明顯

9、降低(p＜0.01)，且肝損傷指標(biāo)ALT和AST的表達(dá)水平也降低(p＜0.01)。
　　綜合上述實驗結(jié)果，可以得出結(jié)論:在年輕血液微環(huán)境的作用下，老年衰老肝細(xì)胞的衰老表型發(fā)生逆轉(zhuǎn)，多倍體肝細(xì)胞比例降低，增殖能力得到提高。而且年輕血液微環(huán)境促進(jìn)了衰老肝細(xì)胞脂肪累積水平的降低，不僅提高了肝細(xì)胞的脂質(zhì)代謝能力，也改善了衰老肝臟的肝功能水平。這一重要發(fā)現(xiàn)，為解決衰老肝細(xì)胞增殖緩慢和老年個體肝衰竭相關(guān)疾病高頻病發(fā)而難治愈問題提供新的思路，也