miR-34a聯(lián)合棕櫚酸促進(jìn)肝細(xì)胞衰老的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:隨著生活習(xí)慣及飲食結(jié)構(gòu)的變化,近年來脂肪性肝病的發(fā)病率越來越高,成為危害公共衛(wèi)生的重要因素。而飽和游離脂肪酸可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性,通過“兩次打擊”導(dǎo)致脂肪性肝病的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)非編碼微小RNA miR-34a在脂肪性肝病中高表達(dá),因此,本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用飽和游離脂肪酸及參與脂肪性肝病調(diào)控的miR-34a建立肝細(xì)胞損傷模型,研究它們對(duì)肝細(xì)胞生物學(xué)活性的影響,為進(jìn)一步探索脂肪性肝病的發(fā)病機(jī)制,以及尋找有效防治脂肪性肝病措施提供

2、前期基礎(chǔ)。
　　方法:(1)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-C1和pEGFP-C1/miR-34a質(zhì)粒到HepG2細(xì)胞中,24h后在熒光顯微鏡下觀察GFP綠色熒光的表達(dá);36h后收細(xì)胞通過RT-PCR檢測(cè)miR-34a的表達(dá)。(2)不同濃度的棕櫚酸處理正常、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-C1和pEGFP-C1/miR-34a質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞,MTT法檢測(cè)棕櫚酸和miR-34a對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響。(3)實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照、棕櫚酸處理、miR-3

3、4a轉(zhuǎn)染、miR-34a轉(zhuǎn)染+棕櫚酸處理四個(gè)組,用DAPI分別給四個(gè)組的細(xì)胞染色,顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化;并用細(xì)胞衰老特異性β-半乳糖苷酶試劑盒檢測(cè)細(xì)胞衰老情況。(4)收集四個(gè)處理組的細(xì)胞,用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞衰老相關(guān)基因P21,P53,細(xì)胞周期相關(guān)基因CDK6,CyclinE2,E2F1以及細(xì)胞炎性因子TNF-α,MCP的表達(dá)。(5) western blot檢測(cè)四個(gè)處理組細(xì)胞周期蛋白CDK6和細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白Sirt1的表

4、達(dá)。
　　結(jié)果:(1)由于載體pEGFP-C1帶有GFP基因,因此表達(dá)質(zhì)粒在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-C1和pEGFP-C1/miR-34a質(zhì)粒到HepG2細(xì)胞中,24h后在熒光顯微鏡下觀察到了綠色熒光的表達(dá);RT-PCR結(jié)果顯示,36h后miR-34a在其轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中高表達(dá),而在空載組中表達(dá)為陰性。(2)不同濃度的棕櫚酸處理HepG2細(xì)胞,MTT法檢測(cè)棕櫚酸可抑制HepG2細(xì)胞增殖,并且呈劑量

5、依賴關(guān)系;而棕櫚酸和miR-34a聯(lián)合處理細(xì)胞可明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖。(3)研究表明,衰老細(xì)胞的細(xì)胞核體積增大,細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶在酸性條件下被催化生成深藍(lán)色的沉積產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示棕櫚酸和miR-34a聯(lián)合處理細(xì)胞DAPI染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核體積增大,應(yīng)用試劑盒檢測(cè)也發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞特異性β-半乳糖苷酶呈深藍(lán)色。(4) RT-PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照細(xì)胞相比較,miR-34a和棕櫚酸聯(lián)合作用于HepG2細(xì)胞,使與細(xì)胞衰老相關(guān)的基因p