重型肝炎小鼠模型肝細胞死亡機制及其基因干預的研究.pdf

1、背景及目的：
　　 HBV感染在發(fā)展中國家和亞太地區(qū)的流行非常嚴重，我國是HBV感染高發(fā)地區(qū)，人群攜帶率約9～10[％]，由HBV引起的重型肝炎是常見的傳染病。重型肝炎是急驟發(fā)生廣泛性肝細胞壞死而引起重度肝功能障礙，出現(xiàn)以肝性腦病為主的肝功能衰竭癥狀之高危疾病。該病病情嚴重，發(fā)展迅猛，發(fā)病機制尚不明了，臨床缺乏上特異、有效的治療靶點和干預手段，除非實施緊急肝移植，絕大部分患者預后不良。因此探索重型肝炎肝細胞死亡機制，并開發(fā)針對其

2、發(fā)病機制、阻斷病理衍變過程的基因治療手段正在成為該領域的研究熱點和發(fā)展方向。
　　 新近發(fā)現(xiàn)的纖維介素(fibroleukin)或fgl2凝血酶原酶(簡稱fgl2)蛋白屬于纖維蛋白家族中的一員，由活化的巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞表達，具有凝血酶原酶的活性，能催化凝血酶原轉化為凝血酶，啟動凝血過程。近來在重型肝炎患者和小鼠模型的實驗研究中，發(fā)現(xiàn)纖維介素(fgl2)與重型肝炎的發(fā)生發(fā)展密切相關。
　　 基因水平干預基因“有害”高

3、表達可以更好地闡明該基因在疾病的發(fā)生發(fā)展中重要作用，也為探索人類重型肝炎臨床治療方法提供了新的思路。使外源基因如何高效快捷導入肝臟一直是該領域研究的瓶頸之一。研究發(fā)現(xiàn)尾靜脈高壓注射可以使質粒DNA在小鼠肝臟獲得高效表達。尾靜脈高壓注射，就是將大體積的裸質粒DNA溶液經(jīng)小鼠尾靜脈快速注入，大量的質粒溶液導致循環(huán)血量的急劇增加，超過心臟負荷，血液積聚在肝竇中不能回流，延長了質粒DNA在肝竇中的停留時間，從而被肝組織細胞攝取。該方法可以廣泛應

4、用于肝臟疾病基因干預的研究。
　　 肝細胞凋亡在肝病的發(fā)生過程中起重要作用，各種原因導致的肝衰竭都存在肝細胞的凋亡。在LPS+D-GalN的FHF模型中，LPS的毒性實際上是由于嚴重的凋亡性肝損傷和肝細胞完全破壞所引起的。在重型肝炎的發(fā)病過程中，F(xiàn)as與TNF系統(tǒng)的激活，Bcl-2家族調(diào)控蛋白比例的失衡等因素都會影響肝細胞凋亡的發(fā)生。另外，mfgl2在肝細胞凋亡的發(fā)生過程中有重要作用，IFN-γ和TNF-α在小鼠體內(nèi)誘導的肝細胞

5、凋亡依賴于mfgl2的表達。然而，有關肝細胞凋亡在MHV-3誘導的小鼠重型肝炎肝衰竭中的重要作用還未見相關文獻報道，因此研究肝細胞凋亡及其調(diào)控機制對重型肝炎肝損傷發(fā)生機理的理解具有重要意義。
　　 具體研究目的如下：
　　 1.建立一簡單可靠的重型肝炎小鼠模型，用于重型肝炎發(fā)病機制和干預治療的研究。
　　 2.針對重型肝炎發(fā)病關鍵基因mfgl2構建一反義質粒，抑制小鼠巨噬細胞系Raw264.7細胞mfgl2的表達

6、。
　　 3.研究mfgl2反義質粒對重型肝炎小鼠體內(nèi)mfgl2表達的改變，以及對小鼠重型肝炎病情發(fā)展的影響。
　　 4.研究凋亡相關蛋白在重型肝炎小鼠模型肝組織中的表達及其促肝細胞凋亡的作用。
　　 方法：
　　 1.采用MHV-3感染Balb/cJ小鼠制造重型肝炎動物模型；重型肝炎小鼠肝組織HE染色進行HAI評分，并分析血清學指標；免疫組化檢測mfgl2的肝組織表達和纖維蛋白的沉積；構建mfgl2反義

7、質粒和對照正義質粒，細胞水平轉染mfgl2反義質粒，并通過Real-time PCR、Western-blot技術檢測mfgl2反義質粒的體外干預效應，通過檢測細胞PCA活性證實mfgl2反義質粒的干預后效應；通過尾靜脈高壓注射將目的基因導入小鼠肝臟，并檢測目的基因在肝臟的表達效率；mfgl2反義質粒高壓注射后，檢測小鼠肝組織病理、血清生化學變化，并觀察重型肝炎小鼠生存率的改變；通過Real-time PCR、免疫組化、原位雜交技術檢測

8、mfgl2反義質粒干預后的小鼠肝臟mfgl2的表達情況；
　　 2.TUNEL法檢測MHV-3誘導的重型肝炎小鼠模型肝細胞凋亡情況，并計算凋亡指數(shù)；
　　 3.免疫組化技術檢測重型肝炎小鼠肝細胞Fas和TNFR1的表達情況；Western-blot檢測重型肝炎小鼠肝細胞Bax和Bcl-2的表達水平，并計算Bax/Bcl-2比值。
　　 結果：
　　 1.MHV-3感染后Balb/cJ小鼠肝組織出現(xiàn)大片肝細

9、胞壞死和炎性細胞浸潤，HAI評分逐步升高，72h達到最高水平(16.0±1.4)；MHV-3感染后Balb/cJ小鼠血清酶ALT、AST，以及血清Tbil逐步升高，72h達到最高水平(8192.3±224.4 IU/L，9410.3±954.4 IU/L，11.6±0.75 umol/L)，血清白蛋白逐步降低，72h達到最低水平(19.6±1.25 g/L)。
　　 2.成功構建mfgl2反義質粒和對照正義質粒，并鑒定無誤；mf

10、gl2反義質粒細胞水平顯著抑制mfgl2的表達，并抑制Raw264.7細胞在IFN-γ刺激后的PCA活性；尾靜脈高壓注射可以將目的基因導入小鼠肝臟，24h重復注射可以使表達效率提高到40[％]。Mfgl2反義質粒高壓注射后，重型肝炎小鼠生存率從0提高到33.3[％]，并顯著改善肝組織病理學變化和血清學指標；mfgl2反義質粒高壓注射后，顯著抑制mfgl2在重型肝炎小鼠模型體內(nèi)的表達，并顯著減少纖維蛋白在肝臟的沉積。
　　 3.M

11、HV-3誘導的重型肝炎小鼠模型與對照組(MHV-3感染A/J鼠)相比，肝細胞出現(xiàn)大片凋亡，凋亡指數(shù)逐步升高，72h達到最高水平(79.8±7.4[％])；MHV-3誘導的重型肝炎小鼠模型與對照組相比，肝細胞表面Fas和TNFR1表達強陽性，同時Bax蛋白表達升高，而Bcl-2蛋白表達降低，Bax/Bcl-2比值升高。
　　 結論：
　　 1.本研究成功地建立了MHV-3誘導的重型肝炎小鼠模型，并通過尾靜脈高壓注射技術將外