CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)哮喘免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)CTLA4Ig基因修飾樹突狀細(xì)胞
　　 目的：構(gòu)建CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細(xì)胞，觀察基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)樹突狀細(xì)胞表型的影響。
　　 方法：小鼠骨髓來源的細(xì)胞懸液，在GM-CSF和IL-4作用下，體外培養(yǎng)7天。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和形態(tài)學(xué)變化。流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表型，確定是否為樹突狀細(xì)胞及其成熟度。確定為樹突狀細(xì)胞后，與重組腺病毒AdCTLA4Ig、AdGFP以及OVA共孵育48小時(shí)，熒光顯微鏡觀察

2、細(xì)胞內(nèi)目的基因表達(dá)，流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。
　　 結(jié)果：1、小鼠骨髓來源的細(xì)胞培養(yǎng)第7天可見樹突狀細(xì)胞特征性的樹枝狀形態(tài)和細(xì)胞集落形成。2、流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)64.01％的細(xì)胞為CD11c陽(yáng)性的未成熟的DC；33.49％的細(xì)胞為CD11c+CD80+細(xì)胞；14.65％的細(xì)胞為CD11c+CD86+細(xì)胞；21.53％的細(xì)胞為CD11c+MHCⅡ+細(xì)胞。3、與重組腺病毒和OVA共孵育48小時(shí)后，熒光顯微鏡下可觀察到樹突狀細(xì)胞內(nèi)發(fā)出綠色熒

3、光。流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)顯示AdCTLA4Ig轉(zhuǎn)染率為41.29％。4、與重組腺病毒和OVA共孵育48小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示42.65％的細(xì)胞為CD11c+CD80+細(xì)胞；22.30％的細(xì)胞為CD11c+CD86+細(xì)胞；32.46％的細(xì)胞為CD11c+MHCⅡ+細(xì)胞。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細(xì)胞。
　　 第二部分 CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細(xì)胞的體外功能研究
　　 目的：研究C

4、TLA4Ig基因修飾的樹突狀細(xì)胞在體外的功能，了解CTLA4Ig轉(zhuǎn)染對(duì)樹突狀細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子IL-10、IL-12的影響以及對(duì)刺激T細(xì)胞活化增殖功能的影響。
　　 方法：分離和培養(yǎng)小鼠骨髓來源的DC。將體外培養(yǎng)7天的樹突狀細(xì)胞分成4組，一組為DC組，一組為DC+OVA組，另外兩組分別加入1μl病毒滴度為1.5×108VP/ml的AdGFP或AdCTLA4Ig和OVA。這4組細(xì)胞分別共培養(yǎng)48小時(shí)后，分離細(xì)胞和上清。上清用ELIS

5、A方法檢測(cè)IL-10和IL-12。細(xì)胞用于和BALB/c小鼠外周血來源的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
　　 結(jié)果：1、CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞后，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞分泌IL-10(P<0.05)。
　　 2、CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞后，降低樹突狀細(xì)胞分泌IL-12的能力(P<0.05)。
　　 3、CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞后，樹突狀細(xì)胞促T淋巴細(xì)胞增殖的能力下降(P<0.05)。
　

6、　 結(jié)論：CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞高表達(dá)IL-10，低表達(dá)IL-12，促T細(xì)胞增殖的能力降低。
　　 第三部分新生小鼠回輸CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細(xì)胞抑制成年期氣道過敏性炎癥
　　 目的：研究將CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細(xì)胞回輸給新生小鼠，觀察其對(duì)成年期OVA致敏/激發(fā)的小鼠氣道炎癥的影響，并探討其發(fā)病機(jī)制。
　　 方法：以O(shè)VA腹腔注射致敏小鼠并霧化吸入激發(fā)的方法制作哮喘模型。將CTLA4I

7、g基因修飾的樹突狀細(xì)胞回輸給新生的BALB/c小鼠，在成年期OVA致敏/激發(fā)小鼠，觀察CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細(xì)胞對(duì)小鼠氣道炎癥的影響。同樣方法設(shè)立對(duì)照組AdGFP干預(yù)組，另設(shè)立空白對(duì)照組、哮喘模型組。通過觀察各組小鼠OVA激發(fā)時(shí)的表現(xiàn)、肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸粒細(xì)胞比例和肺部病理切片改變了解小鼠氣道炎癥情況。ELISA方法測(cè)定血清及BALF的IgE、IL-4、IL-10及INF-γ水平。
　　 結(jié)果：1、OVA腹腔注

8、射致敏小鼠并霧化吸入激發(fā)的方法能成功制作哮喘模型。2、新生小鼠給予CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細(xì)胞明顯減輕成年期哮喘發(fā)作的癥狀、減少肺泡灌洗液中嗜酸性細(xì)胞的生成和病理切片中的炎癥表現(xiàn)。3、CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細(xì)胞可以減輕成年期小鼠哮喘發(fā)作時(shí)的血清和肺泡灌洗液中IgE水平。4、CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細(xì)胞可減輕成年期小鼠哮喘發(fā)作時(shí)的血清和肺泡灌洗液中IL-4水平。5、CTLA4Ig基因修飾的樹突狀細(xì)胞可提高成年期小鼠血清