辛伐他汀抑制骨細(xì)胞凋亡并促進(jìn)骨再生的相關(guān)研究.pdf

1、目的:
　　1、通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法，并從醫(yī)學(xué)影像學(xué)、組織病理學(xué)、分子生物學(xué)等多個(gè)角度，探討辛伐他汀在大鼠脛骨開(kāi)放截骨模型骨愈合過(guò)程中所起的作用，并重點(diǎn)觀察辛伐他汀對(duì)骨細(xì)胞凋亡的作用情況，為后續(xù)的研究提供理論依據(jù)。
　　2、通過(guò)SD大鼠原代骨細(xì)胞分離培養(yǎng)，驗(yàn)證辛伐他汀、骨細(xì)胞凋亡及骨硬化蛋白、RANKL的表達(dá)之間的關(guān)系，并初步探討這之間可能的分子機(jī)制，從而為該藥物在骨科臨床上的應(yīng)用提供更充分的理論依據(jù)。
　　方法:

2、>　　一、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　1、載辛伐他汀克氏針的制備
　　160mg辛伐他汀原料藥溶于由1.5ml乙酸乙酯及100mg PDLLA組成的溶液中，得出濃度為10％W/W的辛伐他汀工作液。將直徑1.0mm、長(zhǎng)30mm的克氏針在辛伐他汀工作液中蘸2次，在層流環(huán)境中自然干燥后-20°保存?zhèn)溆谩?br>　　2、建模及分組。
　　72只雌性SD大鼠隨機(jī)分為辛伐他汀治療組及對(duì)照組。采用Christine等報(bào)道的方法建立SD大鼠脛骨開(kāi)放

3、截骨模型，治療組用載藥的克氏針作髓內(nèi)固定物，對(duì)照組的固定物則僅含PDLLA涂層。
　　3、影像學(xué)檢查
　　于術(shù)后2周、4周及8周，戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，拍攝大鼠右脛骨側(cè)位X線(xiàn)片影，并按照改良Lane-Sandhu X射線(xiàn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)拍攝所得的X線(xiàn)片進(jìn)行評(píng)分。
　　二、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　1、 SD大鼠原代骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)
　　無(wú)菌條件下將3只SD乳鼠的長(zhǎng)骨及顱骨取出，剔除干凈骨膜及其他附著于骨骼上的軟組織，取Han

4、k's平衡鹽溶液將長(zhǎng)骨內(nèi)骨髓組織沖出，然后通過(guò)序貫、交替的膠原酶消化及EDTA脫鈣法進(jìn)行骨細(xì)胞的分離。用α-MEM培養(yǎng)基（含5％胎牛血清+5％小牛血清）培養(yǎng)原代骨細(xì)胞，至細(xì)胞長(zhǎng)至融合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。本研究使用第5-10代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　2、骨細(xì)胞的鑒定
　　骨細(xì)胞的鑒定要點(diǎn)有:(1)細(xì)胞外形特點(diǎn):細(xì)胞外形呈星形或樹(shù)枝狀，形態(tài)偏圓偏短，表面有4個(gè)以上的突觸并與周?chē)?xì)胞形成聯(lián)系;(2)細(xì)胞上清液中堿性磷酸酶測(cè)定值較低（與

5、成骨細(xì)胞相比較）;(3)骨鈣蛋白表達(dá)水平較高。
　　3、骨細(xì)胞凋亡模型的建立
　　采用腫瘤壞死因子-α刺激骨細(xì)胞而形成骨細(xì)胞凋亡模型。為了獲得TNF-α的最佳刺激濃度，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度（5、10、20、40 ng/ml）TNF-α刺激下骨細(xì)胞的總凋亡率，TNF-α作用時(shí)間為24小時(shí)。
　　結(jié)果:
　　一、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　1、影像學(xué)檢查及Lane-Sandhu評(píng)分
　　影像學(xué)檢查提示術(shù)后2周2組

6、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的X線(xiàn)片表現(xiàn)并無(wú)明顯差別，均未見(jiàn)明顯骨痂形成。術(shù)后4周、8周辛伐他汀治療組無(wú)論從骨痂形成量還是愈合質(zhì)量均優(yōu)于對(duì)照組。Lane-Sandhu影像學(xué)評(píng)分顯示:術(shù)后2周，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的評(píng)分為(0.26±0.86)分，對(duì)照組為(0.35±1.00)分，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為P＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。術(shù)后4周，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的評(píng)分為(4.92±1.44)分，對(duì)照組為（3.58±2.06）分，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為P＜0.05，且辛伐他汀治療組優(yōu)于對(duì)照組。術(shù)后8周，實(shí)

7、驗(yàn)組動(dòng)物的Lane-Sandhu評(píng)分為（7.92±2.53）分，對(duì)照組為(5.17±1.94)分，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為P＜0.05，故2組動(dòng)物在術(shù)后4周的Lane-Sandhu評(píng)分差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且治療組優(yōu)于對(duì)照組。
　　2、組織病理學(xué)檢查結(jié)果
　　HE染色結(jié)果顯示:術(shù)后第2周時(shí)，2組動(dòng)物脛骨的骨折間隙由炎性纖維組織填充，均未見(jiàn)明顯纖維性骨痂形成。骨折固定術(shù)后4周，2組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨折端均可見(jiàn)骨痂形成，實(shí)驗(yàn)組的骨痂形成量較多，且骨痂中

8、可見(jiàn)大量新生血管，纖維骨痂逐漸被軟骨性骨痂取締。骨折內(nèi)固定術(shù)后8周，辛伐他汀組軟骨骨痂周邊連續(xù)不斷為新生骨小梁取代，骨小梁粗細(xì)較均勻，且骨小梁排列亦較術(shù)后4周時(shí)整齊，由此可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組硬骨痂已逐漸開(kāi)始塑形過(guò)程。相比之下，對(duì)照組軟骨骨痂數(shù)量相對(duì)較少，軟骨化骨進(jìn)程緩慢，新生小梁狀骨排列紊亂無(wú)序。
　　番紅O-固綠染色結(jié)果顯示2組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織的染色結(jié)果顯示，2組中均可見(jiàn)軟骨性骨痂，且辛伐他汀組骨折部位軟骨組織較對(duì)照組少，說(shuō)明其骨折區(qū)軟骨化骨

9、進(jìn)程比對(duì)照組快。
　　3、Western blotting檢測(cè)結(jié)果
　　Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示術(shù)后2周、4周及8周，辛伐他汀處理組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨痂中骨硬化蛋白及RANKL的蛋白表達(dá)量均顯著比對(duì)照組低;而同一組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在不同時(shí)間期間此兩種蛋白的表達(dá)量亦存在顯著性差異，并呈遞減趨勢(shì)。
　　二、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　1、 SD大鼠原代骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
　　骨細(xì)胞分離培養(yǎng)初期，可見(jiàn)有少許成骨細(xì)胞及成

10、纖維細(xì)胞共同生長(zhǎng)，經(jīng)多次消化、傳代后骨細(xì)胞逐漸純化，形成長(zhǎng)勢(shì)良好、外形獨(dú)特的細(xì)胞系。骨細(xì)胞外形多呈星形或樹(shù)枝狀，細(xì)胞表面有多個(gè)長(zhǎng)突觸，并與周?chē)?xì)胞形成聯(lián)系，而成骨細(xì)胞多外形多為梭形、錐形或立方形，細(xì)胞表面突觸少且細(xì)。骨細(xì)胞體型較成骨細(xì)胞小，但更立體。此外，骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性比成骨細(xì)胞低(p＜0.01)，而骨鈣素表達(dá)水平卻顯著高于成骨細(xì)胞(p＜0.01)。
　　2、最佳TNF-α刺激濃度及辛伐他汀處理濃度
　　流式細(xì)胞術(shù)結(jié)

11、果示，骨細(xì)胞的總凋亡率隨TNF-α刺激濃度升高而相應(yīng)升高(F=71.57，P＜0.000)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，本研究最終選用20ng/ml作為T(mén)NF-α的刺激濃度。MTT比色法檢測(cè)結(jié)果示骨細(xì)胞的活性隨著辛伐他汀刺激的濃度升高而下降(F=57.04，P＜0.000)，根據(jù)結(jié)果，選取10-5 mol/L作為本次實(shí)驗(yàn)辛伐他汀的主要處理濃度。
　　3、 ROS檢測(cè)結(jié)果
　　骨細(xì)胞內(nèi)活性氧簇檢測(cè)結(jié)果顯示，TNF-α顯著刺激ROS的形成（P

12、＜0.01 vs對(duì)照組），而辛伐他汀預(yù)處理則可顯著抑制ROS的形成（P＜0.01 vs TNF-α處理組）。
　　結(jié)論:
　　本研究通過(guò)結(jié)合體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)兩部分，并從影像學(xué)、生物力學(xué)、組織病理學(xué)及分子生物學(xué)等多個(gè)角度，探討辛伐他汀在骨再生方面的生物學(xué)效應(yīng)及分子機(jī)制，著重觀察其對(duì)骨細(xì)胞的影響作用，全文結(jié)果總結(jié)如下:
　　1、局部應(yīng)用辛伐他汀可加速開(kāi)放截骨模型骨折修復(fù)的進(jìn)程及提高骨折愈合質(zhì)量，且這種促進(jìn)效應(yīng)與其抑制骨細(xì)胞凋