降低PKCα水平可抑制Dicer基因的表達(dá)并促進膀胱腫瘤凋亡的機制研究.pdf

1、前言:
　　膀胱癌是泌尿外科最常見的腫瘤，在我國，男性膀胱癌發(fā)病率位于全國惡性腫瘤的第七位，女性排在第十位以后，約90％的膀胱癌為尿路上皮癌，其中約70％為非肌層浸潤性膀胱癌，預(yù)后好。但術(shù)后約有10-15％的機會進展為肌層浸潤性膀胱癌，而浸潤性膀胱癌惡性度較高，常浸潤肌層，預(yù)后較差。因此，尋找治療膀胱癌的有效方法，已成為膀胱癌研究領(lǐng)域的熱點。目前，治療膀胱癌的方法主要圍繞誘導(dǎo)膀胱腫瘤細(xì)胞的凋亡展開，能夠找到一條誘導(dǎo)膀胱腫瘤細(xì)胞凋亡

2、的新途徑將為膀胱癌的治療找到新方向，提供新方法。
　　PKC作為一種蛋白激酶，可以通過磷酸化蛋白質(zhì)特定的絲/蘇氨酸位點來活化靶蛋白，發(fā)揮作用。PKC家族成員可以分成三大類:cPKC（經(jīng)典PKC）包括:PKCα，PKCβ和PKCγ; nPKC（新型PKC）包括:PKCδ，PKCε，PKCη和PKCθ;aPKC（非典型PKC）包括:PKCμ和PKCξ。PKCα作為經(jīng)典PKC家族成員的重要代表，是細(xì)胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的中樞因子。近年來

3、，有許多研究探討發(fā)現(xiàn)PKCα在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，其中也包括其在促進腫瘤生存和抑制其凋亡的過程中的重要作用，特別是對腫瘤細(xì)胞的抗凋亡的作用尤其顯著。并且，有研究也指出，抑制腫瘤細(xì)胞中的PKCα的表達(dá)，可以使多種腫瘤立即陷入凋亡之中。但是其具體的作用機制，目前還有待進一步研究。
　　Dicer是近年發(fā)現(xiàn)的一種Ⅲ型核糖核酸酶，其作用是可以催化miRNA的成熟，miRNA成熟過程的最后一步即是由Dicer催化完成的。并且，有研究發(fā)

4、現(xiàn)在人類基因組中，Dicer蛋白僅有一種拷貝。故而，理論上任何對Dicer蛋白的影響都能夠直接對幾乎全部的miRNA合成產(chǎn)生影響。同時，由于miRNA在細(xì)胞中的廣泛的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用，可以說，Dicer的表達(dá)水平將影響細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白質(zhì)的合成，進而對許多細(xì)胞的行為產(chǎn)生重要影響。
　　本研究旨在探討PKCα和Dicer兩蛋白在膀胱癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)及相關(guān)性，并進一步探討這兩個因子在膀胱腫瘤凋亡中的作用機制，為進一步的研究奠定基礎(chǔ)，

5、進而為膀胱腫瘤的診斷和治療提供新的靶點和視角。
　　方法:
　　一、實時定量PCR檢測PKCα和Dicer在膀胱癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況
　　收集45粒膀胱癌組織或癌旁組織標(biāo)本，液氮速凍后，用Trizol提取組織總RNA后，采用實時定量PCR方法檢測膀胱癌或癌旁組織中的PKCα和Dicer的表達(dá)情況。
　　二、應(yīng)用siPKCα轉(zhuǎn)染5637和T24細(xì)胞系，應(yīng)用Western Blot及RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染前

6、后Dicer表達(dá)的改變情況
　　用siPKCα瞬時轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞系5637、T24及J82，實驗設(shè)轉(zhuǎn)染組及陰性對照組，轉(zhuǎn)染方法和步驟參照脂質(zhì)體說明書進行。轉(zhuǎn)染24小時后收集細(xì)胞，提取總RNA及總蛋白，采用Western Blot和實時定量PCR方法檢驗轉(zhuǎn)染后Dicer的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　三、流式細(xì)胞術(shù)檢測siRNA干擾PKCα和Dicer前后T24及5637的凋亡水平變化
　　應(yīng)用Annexin-Ⅴ/PI染

7、色siPKCα和siDicer干擾前后的T24和5637細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀上檢測對比干擾前后兩種細(xì)胞凋亡的水平變化。
　　四、Caspase-3及PARP活性檢測實驗，檢測應(yīng)用PKC抑制劑或轉(zhuǎn)染siPKCα前后5637和T24細(xì)胞的凋亡水平變化
　　應(yīng)用Caspase-3活性檢測試劑盒及Western Blot檢測應(yīng)用PKC抑制劑或siPKCα處理T24和5637兩種膀胱癌細(xì)胞后， Caspase-3和PARP的活化水平變化

8、，進一步證明PKCα和Dicer對膀胱癌細(xì)胞凋亡是通過Caspase3-PARP通路發(fā)揮作用的。
　　五、siPKCα干擾T24和5637的PKCα表達(dá)后，免疫熒光實驗查看Dicer表達(dá)的位置變化
　　結(jié)果:
　　一、PKCα和和Dicer在膀胱癌組織中的表達(dá)情況及轉(zhuǎn)染siPKCα后在細(xì)胞系中的Dicer的表達(dá)變化
　　(1) PKCα和Dicer在膀胱癌組織中的表達(dá)存在相關(guān)性(r=0.8)。
　　(2)

9、PKCα與Dicer在高級別尿路上皮癌中的表達(dá)要高于低級別尿路上皮癌(Dicer: p＜0.01，PKCα: p＜0.01)及正常尿路上皮(Dicer: p＜0.01，PKCα: p＜0.01);但是在低級別尿路上皮癌與正常尿路上皮中未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(Dicer: p=0.54，PKCα: p=0.59)。
　　(3)實時定量PCR檢測siPKCα干擾后的T24和5637細(xì)胞發(fā)現(xiàn)Dicer的mRNA水平明顯降低。
　　(4)

10、 Westerrn-blot檢測siPKCα干擾后的T24和5637細(xì)胞發(fā)現(xiàn)Dicer蛋白表達(dá)水平明顯降低。
　　二、應(yīng)用siRNA分別抑制膀胱癌細(xì)胞T24和5637的PKCα和Dicer表達(dá)，可促進膀胱癌細(xì)胞凋亡
　　分別利用siRNA技術(shù)抑制24小時后，流式細(xì)胞術(shù)(Annexin-Ⅴ/PI染色)檢測T24和5637，顯示細(xì)胞的凋亡水平均明顯升高。
　　三、證實抑制PKCα或Dicer所際致的凋亡是通過Caspase

11、3-PARP途徑實現(xiàn)的
　　(1)應(yīng)用PKCα抑制劑（Calphostin C和Go6976）分別處理T24及5637細(xì)胞，培養(yǎng)不同的時間后檢測Caspase3的活性水平變化，發(fā)現(xiàn)Caspase3的活化水平與兩種藥物的作用時間成正相關(guān)。
　　(2)應(yīng)用siRNA技術(shù)分別抑制T24和5637細(xì)胞24小時后，發(fā)現(xiàn)Caspase3的活性明顯升高。
　　(3)應(yīng)用PKCα抑制劑（Calphostin C和Go6976）分別處理

12、T24及5637細(xì)胞，培養(yǎng)不同的時間后western-blot檢測PARP的活性變化，發(fā)現(xiàn)PARP的活化水平與兩種藥物的作用時間成正相關(guān)。
　　(4)應(yīng)用siRNA技術(shù)分別抑制T24和5637細(xì)胞24小時后，發(fā)現(xiàn)PARP的活性明顯升高。
　　四、免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)抑制T24和5637細(xì)胞PKCα的表達(dá)后，Dicer的表達(dá)位置不發(fā)生改變
　　在T24和5637細(xì)胞中抑制PKCα的表達(dá)后，用免疫熒光技術(shù)檢測Dicer蛋白，發(fā)