靶向mTORC2信號通路抑制乳腺癌細(xì)胞遷移并促進(jìn)凋亡.pdf

1、背景:
　　 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。通過調(diào)節(jié)磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號及其下游信號途徑，mTOR在細(xì)胞生長、存活和腫瘤耐藥中起關(guān)鍵作用。在細(xì)胞中mTOR以復(fù)合物形式存在:mTOR與raptor、mLst8、Deptor和PRAS40構(gòu)成了mTORC1。mTORC1對雷帕霉素敏感，能磷酸化S6激酶1(p70S6K1)和真核生物起始因子4E結(jié)合蛋白-1(4E-BP1)

2、，促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯。mTOR與rictor、mLst8、mSin1、Deptor和Protor形成了mTORC2。mTORC2對雷帕霉素不敏感，可以磷酸化Akt(S473)。這兩種復(fù)合物通過接受營養(yǎng)、氧氣、能量、壓力和生長因子等細(xì)胞內(nèi)外信號，調(diào)控蛋白翻譯、代謝、細(xì)胞生長增殖、存活和自噬等多種生理過程。超過50％的惡性腫瘤存在mTOR信號通路的過度激活，因而mTOR是重要的癌癥藥物治療靶標(biāo)。
　　 第一代mTOR抑制劑雷帕霉素及其類

3、似物能抑制癌細(xì)胞的增殖，但它們僅在少數(shù)癌癥的治療中取得較好療效，如細(xì)胞淋巴瘤，腎癌和子宮內(nèi)膜癌，多數(shù)腫瘤病人對雷帕霉素不敏感。引起雷帕霉素抵抗的主要原因是:1）雷帕霉素不能完全抑制mTORC1，雖然p70S6K1被強(qiáng)烈抑制，但是4E-BP1和mRNA的翻譯卻對雷帕霉素不敏感;2）不能抑制mTORC2的活性;3）存在mTORC1和Akt之間的負(fù)反饋通路。雷帕霉素類似物可以通過抑制S6K1活性，進(jìn)而抑制胰島素受體底物(IRS-1)的降解，使

4、Akt活性升高并促進(jìn)細(xì)胞存活。
　　 最近開發(fā)的第二代mTOR抑制劑是針對mTOR激酶結(jié)構(gòu)域的ATP-競爭性抑制劑，不但可抑制mTORC1，也可抑制mTORC2與Akt的負(fù)反饋激活。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究證明這類藥物有很好的抑制多種腫瘤效果，部分mTORC1/2抑制劑正處于臨床試驗(yàn)階段。闡明mTORC1/2抑制劑對各種癌癥的治療作用及其抑制腫瘤的細(xì)胞與分子生物學(xué)機(jī)制可為這些藥物的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。
　　 此外，最新的癌

5、癥生物學(xué)研究表明:mTORC2在一些癌癥的發(fā)生與進(jìn)展中起重要作用，mTORC2將成為一種很有前景的腫瘤治療靶標(biāo)，闡明mTORC2在各種腫瘤發(fā)生與進(jìn)展中的作用，探討靶向mTORC2對這些腫瘤的抑制作用及其細(xì)胞與分子生物學(xué)機(jī)制可為特異靶向mTORC2的癌癥治療提供理論依據(jù)。
　　 目的:
　　 mTORC2在乳腺癌發(fā)生與進(jìn)展中的作用以及特異靶向mTORC2對乳腺癌的影響與機(jī)制尚不清楚。本研究通過乳腺癌細(xì)胞系與乳腺癌移植瘤動物

6、模型，探討抑制mTORC2對乳腺癌細(xì)胞生長增殖、遷移和凋亡的影響及其分子機(jī)制，為靶向mTORC2治療乳腺癌提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 本實(shí)驗(yàn)分為體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分。在體外實(shí)驗(yàn)中，以多種乳腺癌細(xì)胞系為模型，使用PP242和OSI027這兩種第二代mTOR抑制劑(mTORC1/2激酶抑制劑)，以及siRNA分別敲低raptor、rictor或mTOR，比較靶向抑制mTORC1或(與)mTORC2活性對乳腺癌細(xì)胞生

7、長、增殖、遷移及凋亡等的影響。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，采用MTT和克隆形成方法研究PP242、OSI027和雷帕霉素在七種乳腺癌細(xì)胞中對細(xì)胞增殖的影響;在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，研究siRNA敲低raptor與rictor、使用PP242和OSI027兩種mTOR激酶抑制劑對細(xì)胞遷移的影響;在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中使用碘化吡啶(PI)染色實(shí)驗(yàn)與WesternBlot檢測活化的凋亡相關(guān)蛋白如活化狀態(tài)的多聚腺苷二磷酸-核糖-多聚酶(cleaved-PARP)

8、的表達(dá)，觀察siRNA敲低raptor或rictor，或使用PP242和OSI027兩種mTOR激酶抑制劑對乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步觀察PP242、OSI027與順鉑聯(lián)合使用是否具有協(xié)同效應(yīng);WesternBlot檢測siRNA敲低raptor或rictor，或PP242和OSI027對mTORC1和mTORC2下游信號分子S6K1、4E-BP1、S6及Akt磷酸化水平的影響;在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，比較PP242和雷帕霉素對裸鼠乳腺移植瘤

9、生長、mTOR信號通路活性以及腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.mTOR激酶抑制劑PP242和OSI027靶向mTORC1/2信號通路并可有效抑制乳腺癌細(xì)胞增殖
　　 在乳腺癌細(xì)胞MCF-7、T47D、MDA-MB-231和Bcap-37中，同時(shí)靶向mTORC1/2的抑制劑PP242和OSI027可劑量依賴地(50-500nM)抑制mTORC2下游底物分子Akt(S473)的磷酸化，而雷帕霉素因負(fù)反饋

10、調(diào)節(jié)引起Akt(S473)磷酸化水平的升高。雖然所有的抑制劑都能抑制S6(S235/236)的磷酸化，但是只有mTOR激酶抑制劑PP242、OSI027能更有效地降低4E-BP1(T37/46)磷酸化。這些結(jié)果表明，mTOR激酶抑制劑能有效的抑制mTORC1和mTORC2，但是雷帕霉素只能抑制mTORC1并負(fù)反饋增強(qiáng)Akt(S473)的磷酸化。
　　 我們進(jìn)一步檢測了PP242、OSI027對七種乳腺癌細(xì)胞系中的增殖抑制效果。M

11、TT與克隆形成實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)靶向mTORC1和mTORC1/2可有效地抑制這些乳腺癌細(xì)胞的生長與增殖。
　　 2.靶向mTORC2而不是mTORC1可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡
　　 Akt是促進(jìn)細(xì)胞存活的關(guān)鍵信號通路，雷帕霉素在MCF-7、MDA-MB-231和Bcap-37中通過負(fù)反饋通路激活A(yù)kt，而mTOR激酶抑制劑PP242和OSI-027能抑制mTORC2與Akt的活性。與PP242和OSI-027抑制Akt磷酸化的結(jié)果

12、一致，這兩種藥物能明顯增強(qiáng)活化狀態(tài)的PARP（cleaved-PARP）的表達(dá)并增加血清饑餓下MCF-7、MDA-MB-231和Bcap-37凋亡細(xì)胞的數(shù)目。
　　 進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn):MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中敲低raptor、mTOR和rictor表達(dá)后可明顯降低S6(S235/236)和/或Akt(S473)的磷酸化，敲低rictor和mTOR而不是raptor能促進(jìn)cleaved-PARP的表達(dá)和增加血清饑餓誘

13、導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此，靶向mTORC2而不是mTORC1能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。
　　 3.在乳腺癌細(xì)胞中抑制mTORC2能增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
　　 順鉑是一種常規(guī)化療藥，目前應(yīng)用在多種癌癥的化療上，可以誘導(dǎo)一系列癌細(xì)胞的凋亡。藥物聯(lián)合指數(shù)(CI)分析是一個(gè)全面分析多藥物聯(lián)合效應(yīng)和拮抗效應(yīng)的方法。CI方法可以解決兩種藥物是否有協(xié)同效應(yīng)和在什么濃度范圍內(nèi)有協(xié)同效應(yīng)。我們進(jìn)一步研究了mTOR抑制劑是否與低劑量順鉑有藥物協(xié)同

14、效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度(20-400nM)PP242和OSI027與順鉑(200nM)共同作用于MCF-7、MDA-MB-231和Bcap-37細(xì)胞時(shí)，CI值低于1.0，表明PP242與OSI-027和低濃度順鉑有協(xié)同效應(yīng)。而雷帕霉素與順鉑共同作用時(shí)，CI值高于1.0，表明沒有協(xié)同效應(yīng)。而且PP242和OSI027，而不是雷帕霉素能增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的cleaved-PARP表達(dá)增加。rictor和mTOR的敲低而不是raptor的敲低能增強(qiáng)

15、cleaved-PARP表達(dá)和增加凋亡細(xì)胞數(shù)目。這些結(jié)果表明，靶向mTORC2而不是mTORC1能增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　 4.靶向mTORC2可抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移
　　 轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌病人死亡的重要原因，在腫瘤轉(zhuǎn)移中癌細(xì)胞侵入周圍組織和血管是轉(zhuǎn)移的第一步，它需要乳腺癌細(xì)胞的遷移。我們通過劃痕愈合實(shí)驗(yàn)研究了mTORC1和mTORC2在乳腺癌細(xì)胞遷移中的不同作用。PP242、OSI027，或轉(zhuǎn)染mTOR、rict

16、orsiRNA比雷帕霉素或轉(zhuǎn)染raptorsiRNA能更顯著地抑制MCF-7細(xì)胞遷移。在MDA-MB-231也中可以看到同樣的結(jié)果，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了mTORC2在乳腺癌細(xì)胞遷移中的關(guān)鍵作用。
　　 5.口服PP242而不是雷帕霉素能有效抑制乳腺腫瘤的生長并誘導(dǎo)乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡
　　 我們通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步比較靶向mTORC1和mTORC1/2對乳腺癌移植瘤的抑制效果。裸鼠接種MDA-MB-231后，口服雷帕霉素和PP

17、242。單獨(dú)使用PP242可顯著抑制腫瘤的生長（腫瘤的表面積和重量），而單獨(dú)使用雷帕霉素卻不能顯著抑制乳腺癌移植瘤生長。口服PP242而不是雷帕霉素能明顯誘導(dǎo)乳腺移植瘤細(xì)胞凋亡。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一樣，PP242在體內(nèi)也能同時(shí)抑制mTORC1(P-S6)和mTORC2(P-Akt)，而雷帕霉素只能抑制mTORC1(P-S6)，而不能抑制mTORC2。這些結(jié)果表明靶向mTORC1/2而不是mTORC1能有效抑制乳腺腫瘤的生長和促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋

18、亡。
　　 結(jié)論:
　　 在乳腺癌細(xì)胞中，mTOR激酶抑制劑Pp242和OSI027能明顯抑制mTORC1和mTORC2信號途徑，而雷帕霉素僅能抑制mTORC1和并導(dǎo)致Akt的負(fù)反饋激活。靶向mTORC2而不是mTORC1能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡和抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移，還能明顯加強(qiáng)化療藥物順鉑的凋亡誘導(dǎo)作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明靶向抑制mTORC1/2而不是mTORC1能明顯抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 因此，mT