雌激素通過上調microRNA-17~92a并抑制其靶向蛋白Bim抗成骨細胞凋亡的機制研究.pdf

1、背景:雌激素對于成骨細胞的抗凋亡作用在雌激素保護成人骨量流失的機理研究中具有極為重要的作用，但其抗成骨細胞凋亡的機理目前尚沒有明確的研究結果。近期的研究結果顯示microRNA在雌激素介導的一系列細胞反應過程中都具有重要的作用，包括細胞的凋亡及分化。因此我們認為在雌激素抗成骨細胞凋亡的過程中，microRNA也可能參與其中。
　　目的:1.驗證雌激素在體內和體外對成骨細胞的抗凋亡作用。2.驗證microRNA參與了雌激素的抗成骨細

2、胞凋亡作用。3.通過尋找micro-RNA與細胞凋亡相關的目標蛋白，分析雌激素對目標蛋白的調控作用。
　　方法:1.選用新生C-57小鼠顱蓋骨提取成骨細胞進行培養(yǎng)，采用流式細胞儀方法觀察成骨細胞在促凋亡因子作用下的凋亡情況以及合并雌激素干擾下的凋亡情況;使用試劑盒對促凋亡因子、雌激素干預的成骨細胞及促凋亡因子、雌激素干預的出生7天小鼠顱蓋骨進行caspase-3活力測定;應用western-blot技術測定促凋亡因子及雌激素干預的

3、出生7天小鼠顱蓋骨bcl-2/bax比值。
　　2.對不同干預組Dicer表達的測定及抑制Dicer表達后細胞凋亡情況進行分析;利用基因芯片技術測定促凋亡因子及合并雌激素干預的成骨細胞中所有microRNA，篩選有意義的表達變化，并用qRT-PCR技術加以驗證;通過體外合成Amo-miRNA，轉染后清除micro-RNA的表達，測定各種干預情況下細胞的凋亡情況。
　　3.通過數據庫搜索micro-RNA與細胞凋亡相關的靶基因

4、，測定不同干預組中目標蛋白的表達情況;分析雌激素對Dicer、micro-RNA及目標蛋白的調控;建立卵巢切除小鼠模型，分析內源性雌激素對Dicer、micro-RNA及目標蛋白的調控。
　　結果:1.在體外Dex、Etopside和TNF-a干預下，增加了成骨細胞的凋亡并使caspase-3活性出現上調，而雌激素可以明顯地降低成骨細胞的凋亡，使caspase-3活性下調;在體內實驗中，Dex增強了caspase-3活性，使Bcl

5、-2/Bax值下降，而雌激素使caspase-3活性減弱，使Bcl-2/Bax值上升。
　　2.在體外Dex、Etopside和TNF-a干預下，DicermRNA表達下降，而雌激素可使其表達上升，體內實驗中Dex使DicermRNA表達下降，雌激素可以恢復其表達;在體外合成siRNA，轉入細胞清除DicermRNA表達，成骨細胞凋亡增加，并可增強促凋亡因子的作用，而雌激素可對抗這種作用;通過基因芯片技術預測micro-RNA-1

6、7～92a與雌激素抗成骨細胞凋亡作用有關，并通過qRT-PCR獲得了驗證;在體外合成Amo-miRNA-17～92a后，轉入細胞發(fā)現成骨細胞凋亡增加，caspase-3活性上調，這種作用和促凋亡因子相協同，而雌激素可減弱這種作用。
　　3.通過TargetScan預測出micro-RNA-17～92a的目標蛋白為與凋亡相關蛋白Bim;Bim的表達量在促凋亡因子干預下上升，而雌激素可降低它的表達，micro-RNA-17～92a的過