氧化低密度脂蛋白影響細(xì)胞信號通路ERK和PI3K-AKT的研究.pdf

1、背景:動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是嚴(yán)重影響人類的健康的主要疾病,其機(jī)理的研究已進(jìn)行了數(shù)十年。目前多數(shù)學(xué)者支持動(dòng)脈粥樣硬化的損傷-反應(yīng)學(xué)說,認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素,而粥樣斑塊的形成是動(dòng)脈對內(nèi)膜損傷反應(yīng)的結(jié)果。導(dǎo)致本病的各種危險(xiǎn)因素可激活一些信號通道蛋白和炎癥因子最終損傷動(dòng)脈內(nèi)膜,其中就包括了修飾的脂蛋白和高血壓的影響。氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipopr

2、otein,ox-LDL)通過多種生物學(xué)作用參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展,如趨化作用、細(xì)胞增殖或細(xì)胞毒性。而高血壓的影響主要體現(xiàn)在腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin anginotensin system,RAS)的作用,血管緊張素Ⅱ(angiotensin,AngⅡ)為該系統(tǒng)的主要活性物質(zhì)。近年來,還發(fā)現(xiàn)了RAS的一些重要新成員:血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)2、Ang-(1-7)、Ang-(1-7)受體Mas、腎素及其前體受體等。本實(shí)驗(yàn)組前期試

3、驗(yàn)證明腎素(前體)受體((P)RR)也存在于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中,該受體與腎素(前體)結(jié)合后,可以通過不依賴于傳統(tǒng)的AngⅡ途徑,激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,上調(diào)某些基因的表達(dá)。
　　 已經(jīng)有研究表明,ox-LDL與血管緊張素Ⅱ有協(xié)同促動(dòng)脈粥樣硬化作用,ox-LDL能夠上調(diào)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá),AngⅡ生成增多,使ox-LDL結(jié)合更多的AngⅡ,但ox-LDL是通過AngⅡ途徑,還是通過其他途徑,如腎素(前體)受體系統(tǒng)、Ang-(

4、1-7)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,上調(diào)基因的表達(dá)還不清楚。
　　 目的:
　　 在離體培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelian cells,HUVECs),觀察ox-LDL對PI3K/AKT和ERK1/2信號通路蛋白的表達(dá),以及在阻斷AT1和AT2后,觀察ox-LDL是否通過的AngⅡ途徑影響PI3K/AKT和ERK1/2信號通路蛋白表達(dá)的變化,從而探討ox-LDL

5、對致動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.體外培養(yǎng)原代HUVECs。
　　 2.以ox-LDL刺激HUVECs不同的時(shí)間,觀察在不同時(shí)間下ox-LDL對ERK和P13K/AKT通路的影響;不同濃度的ox-LDL對ERK通路的影響。
　　 3.以奧美沙坦(10-5M)和PD123319(10-4分別阻斷HUVECS血管緊張素Ⅱ受體AT2、AT1,觀察ox-LDL對ERK、PERK、AKT、PAKT的

6、影響。
　　 4.予wortmannin(0.5×10-6M)阻斷PI3K/AKT信號通路,觀察wortrnannin對ox-LDL引起的AKT激活的影響。
　　 5.PD98059阻斷ERK通路觀察其對ox-LDL引起的ERK路的影響。
　　 6.ERK、PERK、AKT、PAKT均通過western-blot方法檢測。
　　 結(jié)果:
　　 1.ox-LDL不同時(shí)間刺激HUVECs,ERK和AK

7、T蛋白表達(dá)量沒有明顯變化,而磷酸化的ERK和AKT則在15min時(shí)蛋白表達(dá)量量最大;磷酸化的ERK在100ug/mlox-LDL作用下表達(dá)量最大。
　　 2.在阻斷AT1、AT2和ERK通路的情況下,ERK蛋白表達(dá)量無明顯變化;而磷酸化的ERK蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)。
　　 3.在阻斷AT1、AT2和PI3K/AKT信號通路的情況下,磷酸化的AKT蛋白表達(dá)量也明顯下調(diào)。
　　 結(jié)論:
　　 1.ox-LDL可