布比卡因致SH-SY5Y細(xì)胞損傷中ROS爆發(fā)及其作用靶點的研究.pdf

1、近年來,臨床上應(yīng)用局部麻醉藥給患者進行神經(jīng)阻滯和椎管內(nèi)麻醉以及術(shù)后鎮(zhèn)痛的比率逐年增多,但是在工作中發(fā)現(xiàn),部分病人應(yīng)用局部麻醉藥后發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。早期的一些研究表明,局部麻醉藥對神經(jīng)組織的毒性與其劑量、濃度和作用時間成正相關(guān)。離體和在體的實驗顯示,局部麻醉藥可劑量依賴性地造成神經(jīng)組織腫脹、退變、脫髓鞘、空泡化和染色體溶解等。但局部麻醉藥引起神經(jīng)毒性的確切機理還未完全闡明。
　　 布比卡因是臨床常用的局部麻醉藥之一,其引起神經(jīng)及

2、心血管毒性反應(yīng)的報道逐漸增多,并引起高度關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),布比卡因通過抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物I和干擾氧化磷酸化,使ATP生成減少,并可增加線粒體通透性和降低線粒體膜電位,使細(xì)胞凋亡。另有研究發(fā)現(xiàn)布比卡因可誘導(dǎo)Schwann細(xì)胞內(nèi)的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)大量增多,并激活caspase-3(細(xì)胞內(nèi)與凋亡有關(guān)的蛋白酶),觸發(fā)細(xì)胞凋亡。但布比卡因增加線粒體通透性、降低線粒體膜電位和觸發(fā)ROS產(chǎn)生、釋放的

3、啟動因素是什么?目前尚不清楚。
　　 單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,由α、β、γ三個亞單位構(gòu)成,其中α亞單位是催化亞單位,β、γ是調(diào)節(jié)亞單位。它普遍存在于真核細(xì)胞中,參與細(xì)胞能量代謝的調(diào)控。研究表明,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP減少,AMP/ATP比率增高時,AMPK激酶系統(tǒng)被激活,抑制合成代謝途徑,以減少ATP的消耗,并同時促進分解代謝途徑,以增加細(xì)胞

4、內(nèi)ATP的產(chǎn)生。另有研究證實,AMPK的持續(xù)激活可引起細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增多并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此,推測布比卡因可能通過干擾氧化磷酸化和抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物I,使ATP生成減少,導(dǎo)致AMPK持續(xù)激活,并引起細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā)性增多,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 細(xì)胞凋亡主要經(jīng)過兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其一是死亡受體途徑,細(xì)胞表面的死亡受體通過其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與相應(yīng)的死亡配體結(jié)合,將細(xì)胞外凋亡信號傳入細(xì)胞內(nèi),激活caspase-8,而后激活cas

5、pase-3,從而啟動細(xì)胞凋亡；其二是線粒體途徑,氧自由基、鈣超載等刺激因素可使線粒體通透性增加,線粒體膜電位下降,釋放細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor,AIF),進而激活caspase-9和下游的caspase-3,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡與線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)開放有關(guān)。mPTP由電壓依賴性陰離子通

6、道(voltage dependent anion channel,VDAC)、腺苷酸運輸體(adenine nueleotide transloeator,ANT)和親環(huán)素D(cyclophilin D,Cyp-D)構(gòu)成。Cl-可以從開放的VDAC通道進入線粒體內(nèi),并能引起線粒體膜損傷和膜電位下降,導(dǎo)致分布在線粒體膜間的細(xì)胞色素C、AIF等促凋亡分子釋放。因此,布比卡因引起細(xì)胞內(nèi)ROS增多后可能通過促使VDAC開放,導(dǎo)致CI-流入線粒

7、體內(nèi),使線粒體的滲透壓增高、基質(zhì)腫脹、膜電位降低和通透性增大,釋放促凋亡因子,最終使細(xì)胞凋亡。
　　 p38 mitogen-activated protein kinase(MAPK)是絲裂原活化蛋白激酶家族重要成員之一,許多應(yīng)激性刺激如H2O2、TNF-α、脂多糖、高滲液等均能使p38MAPK信號途徑激活。近年來的研究發(fā)現(xiàn),p38 MAPK信號途徑通過控制多種轉(zhuǎn)錄因子的基因表達活性,影響多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生,調(diào)節(jié)一氧化氮和細(xì)胞

8、骨架蛋白的合成,參與應(yīng)激條件下細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等過程。研究發(fā)現(xiàn)利多卡因周圍神經(jīng)毒性與p38 MAPK的激活密切相關(guān)。Lirk等發(fā)現(xiàn)p38MAPK抑制劑4-(4-Fluorophenyl)-2-[4-(methylsulfinyl)phenyl]-5-(4-pyddyl)-1H-imidazole(SB203580)可抑制利多卡因誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞軸突退變。有研究提示,p38 MAPK可能參與疼痛信號因子的活化,它在痛覺的中

9、樞敏感化形成和發(fā)展中可能具有重要作用。因此,推測p38 MAPK與布比卡因的神經(jīng)損傷作用密切相關(guān)。
　　 本研究將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-AMPKα2和pGPU6/GFP/Neo-shRNAAMPKα2分別轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞,調(diào)節(jié)AMPKα2基因在SH-SY5Y細(xì)胞中的表達,研究布比卡因是否通過AMPK導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS大量增多和細(xì)胞凋亡。另一方面,在Cl-通道阻滯劑4,4’-diisothiocyanatostilb

10、ene-2,2’-disulfonic aciddisodium(DIDS)和p38 MAPK抑制劑SB203580干預(yù)的情況下,研究布比卡因所致細(xì)胞損傷中磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)和線粒體內(nèi)Cl-濃度的變化,以明確ROS的作用靶點。
　　 第1章、人AMPKα2基因pEGFP-N1-AMPKα2表達載體的構(gòu)建和鑒定
　　 目的：構(gòu)建表達人AMPKα2基因的pEGFP-N1-AMPKα2載體,轉(zhuǎn)染SH

11、-SY5Y細(xì)胞株,觀測其上調(diào)AMPKα2基因表達的效果。
　　 方法：依據(jù)人AMPKα2基因序列,設(shè)計針對AMPKα2基因的特異引物。培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SH-SY5Y cell line)并提取細(xì)胞總RNA。RT-PCR法擴增AMPKα2基因片段,瓊脂糖凝膠電泳后回收、純化擴增產(chǎn)物,并連接到pEGFP-N1質(zhì)粒載體上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α進行擴增后,提取重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和BamH I酶切鑒

12、定后進行DNA測序。用質(zhì)脂體將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-AMPKα2轉(zhuǎn)染到SH-SY5Y細(xì)胞株,經(jīng)G418篩選陽性克隆細(xì)胞后,用RT-PCR和Western blot法檢測AMPKa2的mRNA和蛋白表達水平。
　　 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。吸光度值采用完全隨機單因素方差分析,組間比較采用LSD法(方差齊)或Dunnett’sT3法(方差不齊)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

13、
　　 結(jié)果：提取得到SH-SY5Y細(xì)胞總RNA。RT-PCR得到大小約為1659 bp目的條帶。從瓊脂糖凝膠中回收的目的條帶成功連接到pEGFP-N1質(zhì)粒載體。經(jīng)DNA測序和酶切鑒定表明,重組質(zhì)粒表達載體pEGFP-N1-AMPKα2構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-AMPKα2轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞株后,細(xì)胞中AMPKα2的mRNA和蛋白表達水平較未轉(zhuǎn)染組有明顯增高(P<0.01)。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了人AM

14、PKα2基因的pEGFP-N1-AMPKα2表達載體。pEGFP-N1-AMPKα2能有效上調(diào)AMPKα2基因在SH—SY5Y細(xì)胞株中的表達,為將來應(yīng)用其研究AMPK在布比卡因致細(xì)胞損傷中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 第2章、人AMPKα2基因shRNA表達載體的構(gòu)建和鑒定
　　 目的：構(gòu)建針對人AMPKα2基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA表達載體,轉(zhuǎn)染SH—SY5Y細(xì)胞株,觀測其對AMPKα2基因的沉默效果。<

15、br>　　 方法：利用Ambion在線設(shè)計軟件設(shè)計4段針對人AMPKα2基因的shRNA干擾序列并設(shè)計1段陰性對照序列,化學(xué)合成shRNA的正義鏈和反義鏈后,將雙鏈shRNA和pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,在卡那霉素抗性平板上篩選重組質(zhì)粒載體,擴增抗性菌落并提取質(zhì)粒。各個重組質(zhì)粒分別進行酶切鑒定。收集酶切鑒定為正確的重組質(zhì)粒進行DNA序列測定。用質(zhì)脂體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞株,經(jīng)

16、G418篩選陽性克隆細(xì)胞后,用RT-PCR和Western blot法檢測AMPKα2的mRNA和蛋白表達水平。
　　 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。吸光度值采用完全隨機單因素方差分析,組間比較采用LSD法(方差齊)或Dunnett’sT3法(方差不齊)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：經(jīng)DNA測序和酶切鑒定表明,4個shRNA表達載體pGPU6/GFP/Neo

17、-shRNA AMPKα2(1),pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα2(2),pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα2(3),pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα2(4)和陰性對照質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo NC構(gòu)建成功。將4個重組質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞后,pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα2(3)轉(zhuǎn)染組的AMPKα2 mRNA和蛋白表達水平明顯低于未轉(zhuǎn)染組

18、和陰性對照組(P<0.01)。pGPU6/GFP/Neo—shRNA AMPKα2(3)能有效抑制AMPKα2基因在SH—SY5Y細(xì)胞中的表達,抑制率為63％。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了4個針對人AMPKα2基因的shRNA表達載體和陰性對照質(zhì)粒。pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα2(3)能有效抑制AMPKα2基因在SH—SY5Y細(xì)胞株中的表達,為將來應(yīng)用其研究AMPK在細(xì)胞損傷中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　

19、第3章、AMPK對布比卡因致SH-SY5Y細(xì)胞ROS增多和凋亡的影響
　　 目的：探討布比卡因是否通過激活A(yù)MPK致SH—SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS增多并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 方法：將細(xì)胞分為pEGFP-N1-AMPKα2組(AMPKα2組),pEGFP-N1組(blank組),pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα2組(siAMPKα2組),pGPU6/GFP/Neo NC組(NC組)和未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的對照組(c

20、ontrol組)。Western blot法檢測AMPKα2和磷酸化AMPKα2(p-AMPKα2)蛋白表達。各組細(xì)胞用含1mmol/l布比卡因的培養(yǎng)液處理。流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測布比卡因處理1、2、3、4、5 h后各組細(xì)胞內(nèi)ROS含量。收集布比卡因處理24 h后的各組細(xì)胞,行MTT檢測細(xì)胞存活率、Hoechst33258染色法和FCM檢測細(xì)胞凋亡率。同時,未用布比卡因處理的各組細(xì)胞在相同時間點檢測上述相

21、同的指標(biāo)。
　　 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后AMPKα2蛋白表達量采用單因素方差分析,組問比較采用LSD法；p-AMPKα2蛋白表達量采用校正的F檢驗Welch法,組間比較采用Dunnett’s T3法。布比卡因處理后細(xì)胞存活率、ROS含量、p-AMPKα2蛋白表達量和細(xì)胞凋亡率采用兩因素析因設(shè)計資料方差分析,組間比較采用LSD法(方差齊)或Dunnett’s T3法(

22、方差不齊)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后,AMPKα2組的AMPKα2蛋白表達顯著高于control組(P<0.01),siAMPKα2組的AMPKα2蛋白表達顯著低于control組(P<0.01)。布比卡因處理后,AMPKα2組的p-AMPKα2蛋白表達顯著高于control組(P<0.01),siAMPKα2組的p-AMPKα2蛋白表達顯著低于control組(P<0.05)。各組細(xì)胞經(jīng)布比卡因

23、處理后,細(xì)胞內(nèi)ROS含量逐漸增多,第3 h達高峰；各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平在第4、5 h出現(xiàn)下降趨勢；AMPKα2組的ROS水平在第1、2、3、4、5 h均高于其它組(P<0.01)；在第2、3和4 h,siAMPKα2組ROS水平低于blank組、NC組和control組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。MTT結(jié)果顯示,布比卡因處理后AMPKα2組存活率為38.92±4.76％,低于control組(52.46±2.93％)(P<0.0

24、1)；siAMPKα2組存活率為65.80±4.10％,高于control組(P<0.01)。FCM檢測結(jié)果顯示,布比卡因處理24 h后AMPKα2組細(xì)胞凋亡率為40.22±3.11％,高于control組(31.76±3.73％)(P<0.01)；siAMPKα2組細(xì)胞凋亡率為23.34±3.68％,低于control組(P<0.01)。Hoechst33258染色法檢測顯示,經(jīng)布比卡因處理后AMPKα2組出現(xiàn)濃染致密的顆粒狀熒光、染

25、色質(zhì)固縮、亮藍(lán)色的凋亡細(xì)胞,其凋亡率為42.82±1.96％,高于control組(32.57±3.18％)(P<0.01);siAMPKα2組細(xì)胞凋亡率為22.21±2.76％,低于control組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　 結(jié)論：下調(diào)AMPKα2的表達可抑制布比卡因誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡,上調(diào)AMPKα2的表達可促進布比卡因誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡。布比卡因可能通過激活A(yù)MPK致SH—SY5Y細(xì)胞ROS

26、爆發(fā)性產(chǎn)生并引起細(xì)胞凋亡。
　　 第4章、布比卡因?qū)H-SY5Y細(xì)胞線粒體和p38 MAPK的影響
　　 目的：研究布比卡因?qū)H-SY5Y細(xì)胞線粒體和p38 MAPK的影響,探討布比卡因致細(xì)胞ROS增多后,ROS的下游作用靶點。
　　 方法：將SH-SY5Y細(xì)胞隨機分為4組:DIDS組、SB203580組、DIDS+SB203580組和無預(yù)處理組(non-pretreated組)。DIDS組、SB203580

27、組和DIDS+SB203580組細(xì)胞分別經(jīng)50μmaol/l DIDS、10μmaol/l SB203580、50μmaol/l DIDS+10μmol/l SB203580預(yù)處理30 min后用含1 mmol/l布比卡因的培養(yǎng)液處理細(xì)胞,non-pretreated組用含1 mmol/1布比卡因的培養(yǎng)液處理細(xì)胞。各組細(xì)胞在布比卡因處理3 h后用FCM分析細(xì)胞內(nèi)ROS水平,四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(5,5’,6,6’-tetra

28、chloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazole-carboeyanide iodine,JC—1)檢測線粒體膜電位,Western blot法檢測p38和p-p38 MAPK蛋白,激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體內(nèi)Cl-濃度的變化。各組細(xì)胞在布比卡因處理24 h后用MTT法檢測細(xì)胞存活率,Hoechst33258染色法和FCM檢測細(xì)胞凋亡。同時,未用布比卡因處理的各組細(xì)胞在相同時間點檢測上述相同的指標(biāo)作為對照

29、。
　　 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。細(xì)胞ROS含量、Cl-熒光強度、線粒體膜電位變化、細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率、p38和p-p38 MAPK蛋白表達量采用兩因素析因設(shè)計資料方差分析,組間比較采用LSD法(方差齊)或Dunnett’s T3法(方差不齊)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：布比卡因處理后,DIDS組和DIDS+SB203580組細(xì)胞內(nèi)ROS水平低于

30、non-pretreated組(P<0.01)。FCM檢測線粒體膜JC-1聚合體/單體熒光強度比值顯示,DIDS組和DIDS+SB203580組分別為0.74±0.04和0.76±0.05,均高于non-pretreated組(0.49±0.01),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體內(nèi)Cl-濃度顯示,DIDS組和DIDS+SB203580組的Cl-濃度均低于non-pretreated組(P<0.01)。We

31、stern blot顯示,DIDS組和DIDS+SB203580組的p-p38 MAPK蛋白表達水平均低于non-pretreated組。MTT檢測顯示,DIDS組和SB203580組的存活率高于non-pretreated組(P<0.01),但均低于DIDS+SB203580組(P<0.05)。FCM檢測細(xì)胞凋亡率顯示,布比卡因處理后DIDS組、DIDS+SB203580組、SB203580組和non-pretreated組分別為31

32、.88±4.41％、26.51±3.56％、33.30±2.01％和39.00±3.18％；SB203580組細(xì)胞凋亡率較non-pretreated組低(P<0.01),但細(xì)胞內(nèi)ROS和JC-1聚合體/單體熒光強度比值與non-pretreated組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Hoechst33258染色法檢測顯示,經(jīng)布比卡因處理后DIDS組、DIDS+SB203580組、SB203580組和non-pretreated組的凋