PBDE-47致SH-SY5Y細胞凋亡中p53作用及其活化機制探討.pdf

1、多溴聯(lián)苯醚（polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）是溴代阻燃劑（brominatedflameretardants，BFRs）類化合物的一種，是一種新型的持久性有機污染物（PersistantOrganic Pollutants，POPs），因其添加量少、熱穩(wěn)定性好、阻燃效率高、對材料性能影響小、價格低廉等眾多優(yōu)點而廣泛被應(yīng)用于社會生產(chǎn)及生活的多個領(lǐng)域。目前PBDEs廣泛存在于多種環(huán)境介質(zhì)和人體生物材

2、料中，且含量呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。體內(nèi)和體外實驗均發(fā)現(xiàn)，PBDEs 暴露可導(dǎo)致多種健康危害，包括肝臟毒性、生殖毒性、神經(jīng)毒性及神經(jīng)發(fā)育毒性、內(nèi)分泌干擾作用及致癌作用等。
　　 腫瘤抑制因子p53（tumor suppression factor p53）基因被稱為人類基因組衛(wèi)士，是細胞內(nèi)重要的抑癌基因之一，其編碼產(chǎn)物為53 kD的P53 蛋白。野生型P53 蛋白是細胞內(nèi)重要的細胞周期“監(jiān)控器”，正常情況下對細胞分裂起著減慢或監(jiān)視的

3、作用，當(dāng)細胞內(nèi)發(fā)生DNA損傷，野生型P53 蛋白可介導(dǎo)細胞周期的阻滯，同時進行細胞內(nèi)DNA修復(fù)，若修復(fù)無效則通過啟動凋亡機制誘導(dǎo)受損細胞發(fā)生凋亡。研究顯示，多數(shù)腫瘤中可發(fā)現(xiàn)p53基因的突變，發(fā)生突變的p53基因由抑癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗?，編碼產(chǎn)物為突變型P53 蛋白，其細胞周期監(jiān)測功能完全喪失，并且可以抑制野生型P53蛋白的正常功能，從而導(dǎo)致受損細胞異常增殖，并最終導(dǎo)致正常細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘毎?br>　　 細胞凋亡（Apoptosis）又稱

4、程序性細胞死亡（Programmed Cell Death，PCD），是指細胞為了維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因調(diào)控的細胞自主的有序死亡。有研究顯示，一定劑量的2,2',4,4’-四溴聯(lián)苯醚（2,2',4,4’-tetrabromodiphenylether，PBDE-47）可誘導(dǎo)人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞發(fā)生凋亡。本實驗室前期研究也顯示，在PBDE-47 誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞凋亡過程中，F(xiàn)as、細胞色素C（Cytochrome C，C

5、yt C）表達水平增高，Pro-Caspase 8 及Pro-Caspase 3細胞內(nèi)水平下降。研究已證實，與PBDEs 結(jié)構(gòu)相近的多氯聯(lián)苯（Polychorinated biphenyls ethers，PCBs）能夠引起細胞內(nèi)P53 蛋白表達水平增高，并引發(fā)p53 依賴性凋亡通路的激活。是否PBDE-47 亦能同樣引起SH-SY5Y細胞P53 蛋白表達水平增高尚無定論，仍需進一步研究。
　　 DNA甲基化修飾是表觀遺傳學(xué)（E

6、pigenetics）中十分重要的一種修飾方式，是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethytransferse，Dnmts）催化，將S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）提供的甲基轉(zhuǎn)移至DNA中CpG 二核苷酸中的胞嘧啶上的第五位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5-methyleytosine，5mC）的過程。目前研究認為，DNA甲基化可使基因發(fā)生沉默，降低其表達水平，而去甲基化改變則與之相反，可使已甲基化沉默的

7、基因重新獲得表達。
　　 鑒于PBDE-47是否引起神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞內(nèi)p53 mRNA和蛋白表達水平增高及p53基因去甲基化改變的情況尚未見文獻報道。因此，本研究擬通過體外培養(yǎng)SH-SY5Y細胞，并處以不同劑量的PBDE-47，觀察p53基因及蛋白表達水平的變化及p53基因啟動子區(qū)的去甲基化改變情況，從而探討p53在PBDE-47 所致的SH-SY5Y細胞凋亡中的作用。
　　 本研究包括以下二部分：

8、　　 第一部分 PBDE-47 對SH-SY5Y細胞p53 mRNA 及蛋白表達水平的影響
　　 目的：探討PBDE-47 對SH-SY5Y細胞p53 mRNA 及蛋白表達水平的影響。
　　 方法：體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞并暴露于不同濃度的PBDE-47（1，5，10 μmol/L），以二甲基亞砜（DMSO）作為溶劑對照，染毒24 h后，使用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）技術(shù)檢測p53 mRNA表

9、達水平變化，同時使用Western Blot 技術(shù)檢測P53 蛋白表達水平的改變。
　　 結(jié)果：Real-time PCR結(jié)果顯示1、5μmol/L 染毒組p53 mRNA表達水平顯著高于對照組（p<0.05）；10 μmol/L 染毒組p53 mRNA表達水平顯著高于對照組及1、5μmol/L 染毒組（p<0.05）。Western Blot 結(jié)果顯示，5μmol/L 染毒組P53 蛋白表達水平顯著高于對照組及1 μmol/L

10、 染毒組（p<0.05）；10 μmol/L 染毒組P53 蛋白表達水平顯著高于對照組及1 μmol/L、5μmol/L 染毒組（p<0.05）。
　　 結(jié)論：一定劑量的PBDE-47可導(dǎo)致SH-SY5Y細胞內(nèi)p53 mRNA和蛋白表達水平的升高。
　　 第二部分 PBDE-47 對SH-SY5Y細胞p53基因啟動子區(qū)甲基化水平的影響
　　 目的：探討PBDE-47 染毒后SH-SY5Y細胞中p53基因基礎(chǔ)啟動子

11、的甲基化水平變化情況。
　　 方法：亞硫酸氫鈉修飾PBDE-47染毒24 h后的SH-SY5Y細胞基因組DNA，針對p53 啟動子區(qū)設(shè)計特異性引物，應(yīng)用PCR技術(shù)擴增修飾后的啟動子區(qū)，擴增產(chǎn)物純化后進行克隆測序。
　　 結(jié)果：實驗設(shè)計p53基因啟動子擴增產(chǎn)物255bp。測序結(jié)果顯示，對照組p53基因基礎(chǔ)啟動子區(qū)中9個待檢測C 均轉(zhuǎn)變?yōu)門；1，5，10 μmol/L染毒組基礎(chǔ)啟動子區(qū)中9個待檢測胞嘧啶（C）均轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?/p>