穩(wěn)定表達牛γ干擾素細胞系的建立與鑒定.pdf

1、牛γ干擾素(BoIFN-γ)是特異性抗原或有絲分裂原刺激機體后,主要由CD4+Th1細胞、CD8+T細胞及NK細胞等所分泌表達的一種細胞因子,具有廣譜抗病毒、抑制細胞增殖和免疫調節(jié)等多種生物學功能。IFN-γ可以作為免疫佐劑,增強疫苗的免疫效果。機體IFN-γ水平的高低在很大程度上可以反映機體的細胞免疫狀態(tài),而抗原特異性的IFN-γ反應則可以作為機體針對某種特定外來抗原的細胞免疫狀態(tài)的指標。因此,制備針對BoIFN-γ特異性單抗,并以此

2、建立抗原特異性的BoIFN-γ免疫學檢測方法,可以進行牛結核等感染性疾病的診斷。本研究應用Flp-In-293細胞成功構建了可以穩(wěn)定表達BoIFN-γ的細胞系。同時,應用特異性單克隆抗體建立了檢測評價BoIFN-γ的夾心ELISA方法。
　　 從重組質粒pVAX1-preBoIFN-γ中擴增出preBoIFN-γ片段,構建重組質粒pCR2.1-preBoIFN-γ并進行測序;將測序正確的重組質粒使用Kpn I和Xba I雙酶切后

3、,將酶切片段連接至表達載體pcDNA3.1-FLAG,構建瞬時表達質粒pcDNAB.1-preBoIFN-γ-FLAG;然后使用Xba I和Apa I雙酶切,將酶切片段連接克隆至表達載體pcDNA5/FRT并進行測序,構建表達載體pcDNA5/FRT-preBoIFN-γ-FLAG。
　　 將重組質粒pcDNA3.1-preBoIFN-γ-FLAG瞬時轉染COS-1細胞,孵育48小時后,間接免疫熒光鑒定結果顯示BoIFN-γ在C

4、OS-1細胞中得到成功表達;采用脂質體轉染法,將重組質粒pcDNA5/FRT-preBoIFN-γ-FLAG與重組酶表達載體pOG44共轉染Flp-In-293細胞,孵育48小時后,用含120μg/ml Hygromycin B的完全培養(yǎng)基進行抗性篩選,3-4周后挑取克隆擴大培養(yǎng),并進行亞克隆,使用ELISA、胞內染色、免疫印跡等方法進行鑒定,將陽性克隆細胞系命名為B1。結果顯示,BoIFN-γ得到成功表達,并且主要以分泌形式表達到細胞

5、上清中,β-半乳糖苷酶活性及Zeocin抗性分析表明,經過有限稀釋法純化后獲得的細胞克隆,不再具有l(wèi)acZ-Zeo融合蛋白活性,目的蛋白可以穩(wěn)定表達。
　　 通過誘導表達重組大腸桿菌BL21(DE3)(pET-30a-BoIFN-γ)和BL21(pGEX-6p-1-BoIFN-γ),并對表達產物進行親和層析純化得到重組蛋白His-BoIFN-γ和GST-BoIFN-γ;以一定量的P3代重組桿狀病毒感染Sf9昆蟲細胞,感染后96h

6、左右,待細胞病變明顯時收集上清,對上清進行處理后得到Bac-BoIFN-γ;牛尾靜脈無菌采集肝素鈉抗凝血,加入適量美洲商陸(PWM)后,置于37℃細胞培養(yǎng)箱刺激培養(yǎng)24h,收集上清獲得天然BoIFN-γ。
　　 使用微量細胞病變抑制法,通過MDBK/VSV細胞系統(tǒng)分別測定重組蛋白His-BoIFN-γ、GST-BoIFN-γ、Bac-BoIFN-γ、FLAG-BoIFN-γ和天然BoIFN-γ的抗病毒活性,結果顯示其抗病毒效價分

7、別達到8.389×107 U/mg、6.554×105 U/mg、4.069×104 U/ml、1.024×104 U/ml和1.28×103U/ml,具有較高抗病毒活性牛γ干擾素的獲得為其開發(fā)應用提供了重要的生物材料。
　　 抗病毒分析方法(Antiviral assay,AVA)是第一個建立起來的檢測干擾素樣品相對活性或效能的生物學方法,現(xiàn)有的干擾素生物學活性鑒定方法普遍存在費時、繁瑣、不夠精確、特異性差等一系列缺陷,亟待改