小型豬腎損傷疾病模型的構(gòu)建及干預研究.pdf

1、第一部分:
　　目的:急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)是一種常見,具有高致死率的特點的臨床綜合征,目前尚缺乏有效的預防和治療措施。同時,AKI也是導致慢性腎臟病和終末期腎病最終進展的重要因素,給社會帶來了巨大的經(jīng)濟負擔。慶大霉素等氨基糖苷類抗生素是治療革蘭陰性菌感染最常用的抗生素。腎毒性和耳毒性等嚴重并發(fā)癥極大限制了氨基糖苷類抗生素的臨床應用。目前,研究發(fā)現(xiàn)氧化損傷在慶大霉素腎毒性的發(fā)生中具有重要作用

2、。自噬(autophagy)是細胞中清除損傷生物大分子和線粒體等細胞器,維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要保護機制。同時,自噬具有減輕細胞氧化損傷的作用。目前,自噬在慶大霉素誘導腎毒性中的作用機制以及具有抗氧化作用的N-乙酰半胱氨酸(NAC)和自噬增強劑雷帕霉素對慶大霉素腎損傷中自噬的影響還未明確。
　　本研究擬構(gòu)建慶大霉素腎損傷小型豬模型,觀察在不同慶大霉素給藥時間腎臟自噬水平,氧化損傷,炎癥和凋亡的變化。此外,觀察N-乙酰半胱氨酸和雷帕霉素對

3、慶大霉素腎病理損傷,腎臟氧化損傷,凋亡和自噬的影響。這對于進一步明確慶大霉素腎損傷的發(fā)生和發(fā)展機制以及探索改善慶大霉素腎毒性的新型治療方案具有重要意義。
　　方法:第一,我們采用5,6.85,10,15,20,40,60,80和100mg/kg慶大霉素連續(xù)肌注10天,觀察小型豬血生化和腎臟病理損傷。第二,連續(xù)10天肌注80mg/kg慶大霉素,觀察0天,1天,3天,5天,7天和10天組腎臟病理,血生化,凋亡,氧化損傷,炎癥和自噬的變

4、化。第三,我們觀察給予N-乙酰半胱氨酸或雷帕霉素干預后,慶大霉素腎損傷中腎臟病理損傷,血生化,氧化損傷以及自噬的變化。
　　結(jié)果:首先,在劑量依賴性研究中,與正常對照組相比,80mg/kg組和100mg/kg組小型豬血肌酐和尿素氮水平顯著升高,腎臟病理病理損傷顯著加重。
　　第二,在時間依賴性研究中,與0天組相比,10天組血肌酐和尿素氮水平顯著升高,10天組腎臟損傷顯著加重,此外,與0天組小型豬相比,炎癥因子表達顯著升高,凋

5、亡加重,線粒體自噬標志物Bnip3以及其上游轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α顯著降低,自噬流標志物p62/SQSTM1和多聚泛素聚集體表達顯著升高,凋亡,蛋白質(zhì),脂質(zhì)和DNA氧化損傷加重。
　　第三,我們觀察了慶大霉素注射10天的同時,給予N-乙酰半胱氨酸和雷帕霉素干預。與慶大霉素模型組相比,N-乙酰半胱氨酸組和雷帕霉素組血肌酐和尿素氮水平,腎小管損傷評分均無顯著性改變。此外,腎臟自噬流標志物p62/SQSTM1和多聚泛素聚集體表達顯著降低,

6、Bnip3以及其上游轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α顯著升高,氧化損傷標志物8-OHdG,4HNE和蛋白質(zhì)羰基表達下降,凋亡細胞減少。
　　結(jié)論:隨著慶大霉素給藥時間的延長,小型豬腎臟的自噬功能下降,近端腎小管上皮細胞中線粒體腫脹和嵴斷裂加劇,凋亡細胞數(shù)目增多和氧化損傷顯著加重,表明自噬功能受損可能在慶大霉素腎毒性的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。N-乙酰半胱氨酸和雷帕霉素可減輕慶大霉素腎損傷的氧化損傷,凋亡水平,但尚未顯著改善慶大霉素腎毒性的血生

7、化和腎臟病理損傷。
　　第二部分:
　　目的:先天性腎病綜合征(Congenital nephrotic syndrome, CNS)是一種較常見的遺傳異質(zhì)性疾病。其中,芬蘭型先天性腎病綜合征(NPHS1)最為常見,在芬蘭人群中的發(fā)病率為1/8300。NPHS1以成熟早,大胎盤和胎兒期蛋白尿,腎臟足細胞足突消失為主要特征。目前,腎移植是唯一有效的治療方式。目前人們發(fā)現(xiàn)芬蘭型先天性腎病綜合征是由于NPHS1基因的主要型和次要型

8、基因突變所致。65％的芬蘭型先天性腎病綜合征是NPHS1的第2外顯子的CT缺失導致的純合子突變。目前,NPHS1-/-小鼠出生24小時后死亡,極大限制疾病的研究。豬作為一種與人類在生理學及解剖學上高度相似的生物,在生物醫(yī)學研究中具有重要的價值。近年來,類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)成為定點基因修飾,構(gòu)建基因敲除動物疾病模型的重要方法。本實驗我們擬通過TALEN技術(shù)構(gòu)建小型豬先天性腎病綜合征疾病模型,為先天性腎病綜合征的治療奠定

9、基礎。
　　方法:我們?nèi)?日齡和12月齡的雄性中國實驗用小型豬的心,肝,脾,腎,大腦,胰腺,大腸和骨骼肌組織。①采用RT-PCR和Western blot方法檢測NPHS1基因和nephrin蛋白表達。②采用免疫組化方法檢測nephrin在腎臟的定位表達。③采用PCR和測序方法鑒定中國實驗用小型豬外顯子2的堿基序列。④采用3’RACE和5’RACE方法檢測NPHS1cDNA的3’和5’端未知序列。⑤采用Golden Gate方法構(gòu)

10、建針對NPHS1外顯子2的TALEN載體。⑥采用核轉(zhuǎn)染方法電轉(zhuǎn)小型豬原代成纖維細胞。⑦采用細胞基因組提取和PCR-測序方法鑒定陽性細胞。
　　結(jié)果:①RT-PCR和Western blot結(jié)果證實了NPHS1基因只在小型豬腎臟中表達;②免疫組化結(jié)果顯示NPHS1編碼的nephrin蛋白位于小型豬腎臟足細胞。③BamHI和ClaI雙酶切和測序方法驗證了針對NPHS1基因外顯子2的TALEN載體DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與小型豬NPHS1基因外

11、顯子2堿基序列匹配。④G418(500ug/ml)篩選核轉(zhuǎn)染后原代成纖維細胞得到的單克隆成纖維細胞,經(jīng)基因組PCR和測序驗證后,我們得到22個單細胞克隆點,其中基因敲除細胞克隆點10個,2個雙敲,8個單敲,TALEN敲除效率達到47.6%。
　　結(jié)論:我們首先證實了NPHS1基因只在中國實驗用小型豬腎臟表達,與NPHS1在人類腎臟表達特點相同。其次,我們采用TALEN技術(shù)和核轉(zhuǎn)染技術(shù)篩選出雙敲的原代小型豬原代成纖維細胞,為下一步核