中國MSM人群HIV-1原發(fā)感染者不同疾病進(jìn)展階段原代分離株復(fù)制適應(yīng)性研究.pdf

1、目的:
　　 人類免疫缺陷病毒(human immunodefi后病毒與機體免疫應(yīng)答相互作用的初始階段，高水平病毒復(fù)制是其重要特征[1]。病毒復(fù)制適應(yīng)性是指病毒因其遺傳多樣性導(dǎo)致快速進(jìn)化并在感染宿主過程中改變自身復(fù)制能力從而適應(yīng)宿主環(huán)境的能力[2]。對于原發(fā)感染者病毒復(fù)制適應(yīng)性研究較少，爭議較多。多數(shù)研究者認(rèn)為病毒在突破宿主粘膜屏障的過程中經(jīng)歷遺傳瓶頸效應(yīng)，病毒準(zhǔn)群單一且病毒復(fù)制適應(yīng)性低[8]。最新研究從B亞型原發(fā)感染者獲取的原

2、代分離株病毒具有較高的復(fù)制適應(yīng)性[10]。國外研究顯示B亞型及CRF_BC亞型慢性感染者病毒復(fù)制適應(yīng)性與HIV-1感染者疾病進(jìn)展密切相關(guān)，由病毒和宿主因素共同影響病毒復(fù)制適應(yīng)性。提示復(fù)制適應(yīng)性下降可能是延緩疾病進(jìn)展的重要因素。病毒復(fù)制適應(yīng)性可以作為疾病進(jìn)程的指標(biāo)，甚至對于HIV感染者疾病進(jìn)程的特定階段，HIV復(fù)制能力的變化較病毒載量意義更大。
　　 針對我國MSM人群CRF01 AE原發(fā)感染者及慢性感染者病毒復(fù)制適應(yīng)性情況及不同

3、病毒復(fù)制適應(yīng)性對疾病進(jìn)展的影響尚不明確。原代分離株能有效代表原發(fā)感染者病毒適應(yīng)性情況[11]。而對于我國MSM人群CRF01 AE原發(fā)感染者血漿分離株與外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分離株病毒差異尚不明確。本研究以HIV-1原發(fā)感染者(Primary HIV-1 infection，PHI)和慢性感染(Chronic HIV infection，CHI)為研究對象，以HI

4、V-1基因組中env，nef,gag區(qū)為研究目標(biāo)，以TA克隆的方法獲取感染原發(fā)感染者血漿、血漿原代分離株株及PBMC原代分離株序列，對比原發(fā)感染者病毒及其原代分離株病毒特征差異ciency virus，HIV)原發(fā)感染指HIV侵入機體。利用原代分離株對不同疾病進(jìn)展結(jié)局的原發(fā)感染者及慢性感染者進(jìn)行體外病毒適應(yīng)性檢測，觀察不同疾病進(jìn)展結(jié)局感染者病毒復(fù)制適應(yīng)性變化。
　　 方法:
　　 一、研究對象
　　 原發(fā)感染12

5、例，慢性感染者11例。
　　 二、實驗方法
　　 （一）病毒核酸提取
　　 以140μl血漿按照QIAamp Viral RNA Mini Kit說明書步驟提取病毒基因組RNA。以1×106個細(xì)胞按照QIAamp DNA Blood Mini Kit說明書步驟提取前病毒基因組DNA。
　　 （二）PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化及基因序列測定
　　 使用反轉(zhuǎn)錄PCR和套式PCR方法，分別擴(kuò)增gag基因、env

6、基因及nef基因。PCR產(chǎn)物純化參照QIAquick Gel Extraction Kit操作步驟。利用測序引物進(jìn)行測序反應(yīng)，純化后上機檢測。
　　 （三）PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化
　　 取終產(chǎn)物5μ1進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)Ultra-Violet Product凝膠成像后與marker比對，確認(rèn)所需片段，用QIAquik Gel Extraction Kit試劑盒純化基因片段。
　　 (四)TA克隆
　　

7、 擴(kuò)增的基因片段插入克隆載體pMDTM18-T Simple Vector，轉(zhuǎn)入化學(xué)感受態(tài)菌DH5a擴(kuò)大培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒DNA雙脫氧終止法測序。
　　 （五）序列分析
　　 采用BioEdit軟件對測序結(jié)果進(jìn)行編輯處理，然后進(jìn)行拼接。用Mega5.0軟件自展法(bootstrap)重復(fù)運算1000次構(gòu)建Neighbor-Joining(NJ)進(jìn)化樹。利用Mega軟件中的distance程序計算序列間的基因距離。

8、　　 （六）病毒載量測定
　　 以1ml血漿采用標(biāo)準(zhǔn)版模板制備法提取RNA，使用COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-12.0(ROCHE)以TaqMan RT-PCR方法測定病毒載量。
　　 （七）CD4+T淋巴細(xì)胞測定
　　 20μl CD4/CD8/CD3 TriTEST試劑加入TruCOUNT管中，加入50μl抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450μl，室溫避光15

9、min，用FACS MMLTISET軟件檢測并進(jìn)行自動分析、計算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴細(xì)胞絕對值及相應(yīng)比值等。
　　 （八）HIV-1病毒分離
　　 利用密度梯度離心法分離正常人和HIV-1感染者的PBMC;采用PBMC共培養(yǎng)法及血漿共培養(yǎng)法分離病毒。每3-4天換液1次，每7天添加1次經(jīng)PHA刺激生長3天的正常淋巴細(xì)胞。定期對培養(yǎng)細(xì)胞上清中的HIV-1p24抗原含量進(jìn)行檢測。
　　 （九）HIV-1復(fù)

10、制適應(yīng)性檢測（平行感染實驗）
　　 利用平行感染時實驗檢測病毒復(fù)制能力
　　 （十）HIV-1 p24抗原檢測
　　 參照美國Zeptometrix公司HIV-1 p24抗原定量檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測。
　　 （十一）統(tǒng)計學(xué)處理
　　 本研究涉及統(tǒng)計分析和相關(guān)性分析均采用spss17.0軟件包處理。
　　 結(jié)果:
　　 一、HIV原發(fā)感染者血漿、血漿分離株及PBMC分離株NJ系統(tǒng)

11、進(jìn)化樹、基因多樣性及病毒復(fù)制適應(yīng)性比較
　　 1、HIV原發(fā)感染者血漿、血漿分離株及PBMC分離株NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹
　　 血漿序列、血漿分離株及PBMC分離株病毒序列具有較高的遺傳同質(zhì)性且散在均勻分布。
　　 2、血漿中基因序列、血漿分離病毒株及細(xì)胞病毒分離株基因序列多樣性比較
　　 原發(fā)感染者V期病毒Env區(qū)血漿序列與血漿分離病毒株序列間多樣性差異大于血漿序列與細(xì)胞病毒分離株間多樣性差異。IV期病毒血漿中

12、基因序列、血漿分離病毒株及細(xì)胞病毒分離株基因序列多樣性差異較小。Nef區(qū)血漿中基因序列、血漿分離病毒株及細(xì)胞病毒分離株基因序列多樣性差異較小。Gag區(qū)血漿中基因序列、血漿分離病毒株及細(xì)胞病毒分離株基因序列多樣性差異較小。HIV感染早期病毒分離培養(yǎng)對于病毒env區(qū)多樣性有增加趨勢，但對nef區(qū)及gag多樣性改變較小。
　　 3、血漿分離病毒株與PBMC病毒分離株的病毒復(fù)制適應(yīng)性血漿分離病毒株復(fù)制適應(yīng)性與PBMC病毒分離株無顯著性差

13、異(P=0.28)。
　　 二、HIV原發(fā)感染者第一點及感染后一年至兩年病毒復(fù)制適應(yīng)性、病毒載量及CD4+T細(xì)胞數(shù)量的動態(tài)觀察與比較HIV原發(fā)感染者原代分離株的復(fù)制適應(yīng)性顯著高于感染一年以后(P=0.016)。
　　 三、不同疾病進(jìn)展結(jié)局的原發(fā)感染者病毒適應(yīng)性、病毒載量及CD4+T細(xì)胞比較
　　 TP與RP原發(fā)感染者病毒復(fù)制適應(yīng)性沒有顯著差異，原發(fā)者高病毒復(fù)制適應(yīng)性對感染者疾病進(jìn)展影響較小(P=0.49)。TP與

14、RP原發(fā)感染者早期CD4+T細(xì)胞計數(shù)差異顯著(P=0.007)，表明原發(fā)感染者CD4+T基線值細(xì)胞數(shù)量影響其疾病進(jìn)展。
　　 四、不同疾病進(jìn)展結(jié)局的慢性感染者病毒復(fù)制適應(yīng)性、病毒載量及CD4+T細(xì)胞計數(shù)對比
　　 TP與RP慢性感染者毒復(fù)制適應(yīng)性差異顯著(P=0.038)，提示慢性感染者病毒復(fù)制適應(yīng)性影響其疾病進(jìn)展。
　　 結(jié)論:
　　 1.感染早期血漿分離原代毒株與PBMC分離原代毒株與血漿中病毒無顯著