中國HIV-1感染者NKT細胞與疾病進展的相關性研究.pdf

1、前言： 艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的免疫缺陷性疾病，目前尚無治愈手段，疫苗的研究也始終未有突破，根本原因在于對HIV生物學和人體免疫應答機制及兩者之間的相互作用關系等科學問題缺乏本質上的理解和認知，特別是對免疫系統(tǒng)中起關鍵調控作用的因子作用仍知之甚少。在免疫系統(tǒng)中，NKT細胞(

2、natural killer T cell)表達恒定T細胞受體(TCR)αβ，可活化T細胞、B細胞、NK細胞，是天然免疫和適應性免疫之間的橋梁，為免疫系統(tǒng)中重要的調控細胞之一。因此，盡管其數(shù)量較少(人類約占外周血單個核細胞的0.01-1％)，但在抗病毒、細菌、真菌和寄生蟲、抗腫瘤及自身免疫病中均發(fā)揮了重要作用，其在HIV感染中的作用也日益引起重視。國外研究顯示，NKT細胞高表達CCR5，占T淋巴細胞百分率在急性HIV感染期顯著減少，且隨

3、疾病進展數(shù)量不斷下降。近期研究顯示，用NKT細胞特異性抗原α-半乳糖酰基鞘氨醇(α-GalCer)做HIV DNA疫苗佐劑可顯著提高HIV特異性T細胞及中和抗體反應。上述研究結果提示，NKT細胞在HIV感染疾病進程中可能發(fā)揮重要作用。中國人群和歐美人群遺傳背景不同，由其影響的細胞數(shù)量及表面分子表達水平可能存在差異，目前尚無HIV感染不同疾病進展階段NKT細胞數(shù)量變化和中國HIV感染者NKT細胞及其亞型數(shù)量、CCR5表達水平的報道。本研究

4、用Vα24+Vβ11+CD3+定義NKT細胞，研究中國HIV感染者不同疾病進展階段NKT細胞及其亞型數(shù)量、CCR5表達水平及與HIV感染者疾病進程的相關性，為HIV免疫致病研究提供新的思路。 材料和方法； 1、研究對象 53例未經抗病毒治療的HIV/AIDS患者均來自中國河南，其中男性26例，女性26例，年齡分布為30-68歲(40.7±9.2)，所有患者均經Genelab公司蛋白印跡試劑盒確認為HIV抗體陽性。

5、根據(jù)HIV感染時間和CD4+T細胞數(shù)量將上述患者分為HIV感染緩慢進展組(SP組，感染時間>10年，CD4+T細胞>500個/μl)、典型進展HIV組(HIV組，CD4+T細胞介于200-500個/μl之間，無艾滋病指征性疾病)和典型進展AIDS組(AIDS組，CD4+T細胞<200個/μl或出現(xiàn)艾滋病指征性疾病)。53例HIV/AIDS患者中SP組12例、HIV組28例、AIDS組13例。健康對照組為19例隨機抽取的HIV抗體陰性、未

6、暴露于HIV的健康人，性別、年齡均與HIV/AIDS患者匹配，平均年齡為24-60歲(32.5±12.2)，其中男性10名，女性9名。 2、T細胞、NK細胞絕對值檢測 T絕對值依據(jù)1997年美國CDC關于HIV感染者CD4+T細胞檢測指導方法，應用BD公司TruCOUNT管、FACSCalibur流式細胞儀MULTISET軟件檢測。將20μl CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP試劑加入絕對計數(shù)管中，經反向加樣法

7、加入50μ1抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450μl，室溫避光15min，F(xiàn)ACSMULTISET軟件檢測并進行自動分析，計算CD3+T/CD4+T/CD8+T淋巴細胞絕對值。 將20μlCD45FITC/CD16+56+PE/CD3PerCP試劑加入絕對計數(shù)管中，經反向加樣法加入50μl抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450μl，室溫避光15min，F(xiàn)ACS MULTISET軟件檢測并進行自動分析，計算N

8、K細胞絕對值。 3、NKT細胞及其亞型絕對值、表面CCR5表達水平的檢測 密度梯度離心法分離HIV感染者及健康人PBMC。向流式管中加入2x106PBMC及以下熒光標記的單抗進行染色：anti-Vα24-FITC、anti-Vβ11-PE、anti-CD3-PerCP、anti-CCR5-APC、anti-CD4-PE-Cy7，混勻后室溫避光30分鐘。用PBS洗滌后加入含1％多聚甲醛的PBS重懸，F(xiàn)ACSAria流式細胞

9、儀Diva軟件進行分析。以FSC、SSC定義淋巴細胞、CD3-PerCP、Vα24-FITC、Vβ11-PE定義NKT細胞，計算NKT細胞占CD3+T細胞的百分比、CD4+/CD4-NKT細胞亞型占總NKT細胞的百分比及其CCR5的表達率。NKT細胞絕對值由其占CD3+T細胞的百分比乘以CD3+T細胞絕對值獲得。 4、統(tǒng)計學分析 應用SAS9.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。不同疾病進展階段HIV感染者NKT細胞及其亞型數(shù)量、C

10、CR5表達水平等用多個獨立樣本兩兩比較的Nemenyi法進行比較，NKT細胞數(shù)量與疾病進程相關性采用Spearman秩相關檢驗，P<0.05視為具有統(tǒng)計學意義。 實驗結果 1、HIV/AIDS患者NKT細胞及其亞型水平 通過檢測外周血中NKT細胞數(shù)量發(fā)現(xiàn)，HIV/AIDS患者NKT細胞數(shù)量顯著低于健康對照組(P<0.05)，AIDS組、HIV組、SP組、健康對照組NKT細胞均數(shù)依次上升，其中AIDS組顯著低于健康

11、對照組(P<0.05)。HIV/AIDS患者CD4+NKT細胞數(shù)量顯著低于健康對照組(P<0.05)，其中AIDS組顯著低于SP、HIV組和健康對照組(P<0.05)，SP、HIV組和健康對照組之間無顯著差異。HIV/AIDS患者CD4-NKT細胞數(shù)量顯著低于健康對照組(P<0.05)，其中AIDS組顯著低于健康對照組(P<0.05)。不同疾病進展階段HIV/AIDS患者NKT細胞占T淋巴細胞的百分率，CD4+/CD4-NKT細胞的比值

12、，隨疾病進展有降低趨勢，但無顯著差異。 2、NKT細胞及其各亞型CCR5的表達率 HIV組及AIDS組患者CD4+CCR5+NKT細胞占NKT細胞百分率顯著低于健康對照(HIV組：1.23±2.34％；AIDS組：0.61±1.23％；健康對照：1.64±2.22％)。HIV/AIDS患者CCR5+NKT細胞中，CD4+NKT細胞的百分率(32±14％)顯著低于CD4-NKT細胞(62±25％)(P<0.05)。HIV/

13、AIDS患者NKT細胞CCR5表達率為9.57±12.97％，與健康對照(5.64±5.54％)無顯著差異，CD4+NKT細胞CCR5表達率為4.42±7.16％，與健康對照(3.59±4.41％)無顯著差異(P>0.05)。 3、NKT細胞及其亞型與疾病進展的相關性 HIV/AIDS患者NKT細胞與CD4+T細胞顯著正相關(r=0.33，P<0.05)，CD4+NKT細胞與CD4+T細胞呈顯著正相關(r=0.51，P<