遼寧MSM人群HIV-1原發(fā)感染者病毒全基因組序列特征研究.pdf

1、目的：
　　 艾滋病是目前對人類社會威脅最大的傳染性疾病之一。由于HIV-1存在高水平的遺傳變異性，盡管抗病毒藥物已經(jīng)普遍應(yīng)用于艾滋病的治療，但多年來艾滋病的防治及疫苗的研究并未取得突破性進(jìn)展。最新評估報告表明，男男性傳播已成為HIV-1感染的重要傳播途徑，男男同性戀是我國今后要重點關(guān)注和防治的人群，而且我國人群的遺傳背景又與歐美及非洲人種明顯不同，其免疫應(yīng)答極有可能有新的特點。但目前我國對于男男同性戀人群感染HIV-1的分子流

2、行病學(xué)等研究還非常有限，針對我國男男同性戀中HIV-1感染者的疫苗和治療研究缺乏HIV病原學(xué)免疫學(xué)等基礎(chǔ)資料的支持，因此了解男男同性戀原發(fā)感染者體內(nèi)transmitted/founder virus的生物學(xué)和基因組特征及病毒進(jìn)化和傳播關(guān)系，是今后對于HIV-1高危人群開展防治工作的必要前提。
　　 本研究選取21例我國遼寧省男男同性戀人群中HIV-1原發(fā)感染病例，采用SGA/S方法獲取病毒全基因組序列，從病毒全基因組水平分析男男

3、同性戀人群中HIV-1原發(fā)感染者的流行趨勢及感染早期病毒的遺傳變異水平，明確HIV-1感染早期毒株的病毒學(xué)特征，預(yù)測原發(fā)感染者早期Ⅰ型人類白細(xì)胞抗原限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位并分析其氨基酸多態(tài)性，分析與不同疾病進(jìn)展過程相關(guān)的免疫應(yīng)答特征，為我國HIV-1感染的預(yù)防、診斷、監(jiān)測和治療提供重要的數(shù)據(jù)支持。
　　 材料和方法：
　　 1、研究對象
　　 21例從2008年10月開始對800例自愿接受咨詢檢測的遼寧MS

4、M高危人群隊列按1.5個月的隨訪頻率篩查出的原發(fā)感染病例。原發(fā)感染病例入選標(biāo)準(zhǔn)：進(jìn)行血清學(xué)ELISA篩查實驗和wB確認(rèn)實驗，對血清學(xué)檢測陰性者進(jìn)行集合PCR核酸檢測，滿足以下一項或多項條件者①在6個月內(nèi)HIV抗體開始變陽性者②HIV抗體陰性但HIV RNA陽性者③HIV抗體弱陽性但在兩周之內(nèi)可以重復(fù)并OD值較前次升高者④有早期HIV感染的臨床癥狀、HIV抗原陽性及WB抗體檢測少于4條蛋白帶者。EDTA抗凝收集全血樣本，4小時內(nèi)分離血漿，

5、-80℃凍存。
　　 2、血漿樣本RNA的提取
　　 病毒載量大于104c/ml的血漿樣本，直接參照QLAamp（R）Viral RNA Mini Kit（Qiagen）提取病毒RNA。對于載量小于104c/ml的血漿樣本，先進(jìn)行富集（4℃，23600g離心1小時）以獲得濃度較高的血漿RNA，再參照QIAamp（）Viral RNA Mini Kit（Qiagen）提取RNA。以280ul血漿提取病毒基因組RNA，提取物

6、溶于60ul洗脫液中。
　　 3、逆轉(zhuǎn)錄
　　 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系基于SupcrScript（）Ⅲ Reverse Transcdptase Kit（invitrogen）說明書，分兩段逆轉(zhuǎn)錄獲得HIV-1全長基因組。
　　 4、SGA方法Nested-PCR
　　 對cDNA樣本進(jìn)行極限稀釋，根據(jù)泊松分布，使PCR擴增產(chǎn)物陽性率小于30％的cDNA稀釋度能夠確保每個陽性擴增產(chǎn)物中僅有單一樣本的可能性大于80

7、％。故本實驗用Nuclease-Free Water倍比稀釋cDNA，每個稀釋濃度均做8個平行孔，進(jìn)行套式PCR擴增，直至擴增陽性孔少于3個，以保證每個孔中為單一模板擴增產(chǎn)物。
　　 PCR擴增體系基于Platinum（）Taq DNA Polymerase High Fidelity Kit（Invitrogen）說明書，分兩段套式擴增HIV-1 cDNA全長基因組序列。
　　 5、測序及分析
　　 使用ABI

8、3130全自動DNA測序分析儀，根據(jù)雙脫氧終止法用28個引物雙向測通HIV-1約9KB的近全長基因序列。用Contig Express（vision 9.0）進(jìn)行原始的清理和全長基因拼接，出現(xiàn)雙峰時，次峰超過主峰的一半，認(rèn)定該位置為混合堿基。用Bioedit（vision3.3）將序列與HIV DataBase中的參考序列定序進(jìn)行比較，轉(zhuǎn)換為氨基酸序列，分析變異位置及有無規(guī)律性。用MEGA4.1軟件以Kimura雙參數(shù)方法構(gòu)建全長、en

9、v和gag Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹，Maximum composite likelihood方法計算序列間的基因距離。
　　 6、細(xì)胞嗜性分析
　　 通過V3環(huán)特異的氨基酸并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)工具PSSM預(yù)測感染毒株的細(xì)胞嗜性，在V3環(huán)第11至25位氨基酸為S/GXXXGPGXXXXXXXE/D、帶正電荷的氨基酸（R/K/H）與帶負(fù)電荷的氨基酸（D/E）數(shù)目差小于5時，可判斷為CCR5；如果11和25位氨基酸為

10、R或Q、帶正電荷的氨基酸（R/K/H）與帶負(fù)電荷的氨基酸（D/E）數(shù)目差大于5時，可判斷為CXCR4。
　　 7、Env氨基酸及糖基化位點數(shù)目分析
　　 用Bioedit軟件結(jié)合網(wǎng)絡(luò)工具N-GlycoSite分析計算樣本Env蛋白各區(qū)氨基酸長度多態(tài)性及糖基化位點數(shù)目。以RCSB Protein Data Bank蛋白數(shù)據(jù)庫中的HIV-1蛋白三維立體結(jié)構(gòu)為模型利用網(wǎng)絡(luò)工具SWISS MODEL，構(gòu)建本實驗樣本的蛋白三維立體

11、構(gòu)象。
　　 8、HLA-Ⅰ限制性CTL表位的預(yù)測
　　 利用網(wǎng)絡(luò)工具IEDB Analysis Resource，根據(jù)本實驗室前期獲得的患者HLA-Ⅰ等位基因分型信息，預(yù)測樣本的HLA-Ⅰ限制性CTL表位，選取其中IC50低于50nM的表位進(jìn)行多肽特征和變異分析。
　　 9、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 應(yīng)用SSPS16.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，病毒載量均轉(zhuǎn)換為對數(shù)進(jìn)行比較。載量、CD4細(xì)胞數(shù)目、特殊氨基酸和糖基化位點數(shù)

12、等不符合正態(tài)分布，選取Spearman為相關(guān)參數(shù)進(jìn)行兩個變量相關(guān)分析，P<0.05為顯著相關(guān)；用非參數(shù)秩和檢驗Wilcoxon參數(shù)分析，P<0.05有顯著性差異。
　　 結(jié)論：
　　 一、SGA/S方法可以獲得原發(fā)感染者體內(nèi)HIV-1單一毒株。
　　 二、遼寧地區(qū)MSM人群HIV-1原發(fā)感染以CRF01AE亞型為主，此外還可見少數(shù)B及CRF07BC亞型，并且CRF01AE亞型中明顯分為兩個分支，分別與我省和東南沿

13、海HIV-1感染人群親緣關(guān)系近。
　　 三、遼寧地區(qū)MSM人群原發(fā)感染HIV-1 Env蛋白某些氨基酸長度多態(tài)性及特殊位點的變異會改變蛋白結(jié)構(gòu)，影響免疫識別。
　　 四、在遼寧地區(qū)MSM人群中引起感染的HIV-1毒株以CCR5嗜性為主；也發(fā)現(xiàn)CXCR4嗜性毒株的傳播，但其病毒載量水平都相對較低。
　　 五、遼寧地區(qū)MSM原發(fā)感染者HIV-1早期預(yù)測到的HLA-Ⅰ限制性CTL表位變異明顯，在個別同源毒株感染的病例中