hBmp4在甲醇酵母中的分泌表達及hBmp4全序列優(yōu)化對其表達的影響.pdf

1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BoneMorphogeneticProteins，BMPs)是一類蛋白質(zhì)生長因子，屬于細胞外的糖基化的蛋白二聚體，C’末端具有較高同源性。骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)又稱骨形態(tài)發(fā)生蛋白2B，具有高效骨誘導(dǎo)活性，可促進骨、軟骨，牙本質(zhì)等硬組織的形成及缺損的修復(fù)。BMP4除了誘導(dǎo)成骨作用之外，還具有廣泛的生物學(xué)活性。研究證實，hBMP4對胚胎、肢芽以及心、眼、腎、神經(jīng)等組織器官的發(fā)育也有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究嘗試建立hBm

2、p4成熟片段在畢赤酵母(Pichiapastoris)中的表達技術(shù)。主要研究工作包括：將表達hBmp4成熟片段的載體質(zhì)粒pPIC9k-hBmp4/dm轉(zhuǎn)化酵母宿主菌株，PCR鑒定基因整合后，搖瓶培養(yǎng)，甲醇誘導(dǎo)表達并用點雜交來快速篩選高表達菌株；以這一表達載體為基礎(chǔ)，依據(jù)酵母密碼子使用偏好性，AT含量分析，結(jié)合軟件RNAstructure(Version4.0)預(yù)測mRNA二級結(jié)構(gòu)，將hBmp4成熟片段內(nèi)Pichiapastoris使用低

3、頻密碼子突變?yōu)槭褂妙l率較高的同義密碼子以期實現(xiàn)高效表達。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和WESTERN-BLOT分析表明rhBMP4的分子量為26KD，在原有13KD的分子上帶有一定程度的糖基化，不存在同二聚體形式的產(chǎn)物；WESTERN-BLOT證實表達產(chǎn)物具有良好的抗原性和特異性；對不同誘導(dǎo)條件的觀察表明：以pH6.0的培養(yǎng)基，保持以終濃度為0.5％的甲醇進行誘導(dǎo)，調(diào)整誘導(dǎo)前菌體生物量在OD600=10左右，誘導(dǎo)4d表達量達到最高；利用蛋