牙鲆Mx基因的克隆、序列分析及在畢氏酵母中的表達(dá).pdf

1、Mx蛋白是干擾素誘導(dǎo)表達(dá)的抗病毒蛋白家族中的成員之一，具有廣譜的抗病毒效應(yīng)，能使細(xì)胞進(jìn)入抗病毒狀態(tài)。哺乳動(dòng)物(包括人)、鳥類以及魚類體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)有Mx蛋白。90年代起，Mx蛋白的研究逐漸引起人們的重視。本研究以牙鲆為材料，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增得到其Mx基因的cDNA序列，構(gòu)建pPIC9K-Mx表達(dá)載體，并在畢氏酵母中實(shí)現(xiàn)了牙鲆Mx蛋白的真核表達(dá)，為以后進(jìn)一步研究牙鲆Mx蛋白的抗病毒機(jī)制打下了良好的基礎(chǔ)。

2、我們首先提取了牙鲆(Paralichthyslethostigma)腎臟的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。我們?cè)贜CBIGenBank網(wǎng)站搜索目前已知的Mx蛋白基因家族各成員的蛋白和核酸序列，用DNASTAR軟件編輯所得的序列，并對(duì)Mx基因家族各成員的氨基酸序列進(jìn)行Megalign比較，找出各成員同源性最高、保守性最強(qiáng)的片段，以設(shè)計(jì)性引物，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增。將RT-PCR產(chǎn)物純化并連接至pEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸

3、桿菌DH5a菌株進(jìn)行克隆測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，RT-PCR所得的cDNA片段全長1980bp，其中編碼區(qū)長1890bp，編碼629個(gè)氨基酸殘基，推測(cè)蛋白質(zhì)分子量大小為71.7kDa。隨后，我們?cè)贜CBI網(wǎng)站對(duì)RT-PCR所得的基因序列進(jìn)行比較分析，Blast比較以及Megalign軟件分析的結(jié)果表明此cDNA片段具有脊椎動(dòng)物Mx蛋白共有的結(jié)構(gòu)特征：一個(gè)三聯(lián)體GTP結(jié)合區(qū)域(GXXXSGKS/T、DXXG、T/NKXD)；一個(gè)發(fā)動(dòng)蛋白家族的

4、典型結(jié)構(gòu)特征序列(LPRGS/KGIVTR)；以及C端高度保守的Leu拉鏈結(jié)構(gòu)區(qū)。至此，我們獲得了牙鲆Mx基因的全長cDNA片段。進(jìn)一步的序列比較與進(jìn)化分析結(jié)果表明，牙鲆Mx基因與日本比目魚等魚類的同源性較高，在75.1％～98.7％之間;而與哺乳動(dòng)物的同源性相對(duì)較低，在50.3％～55.1％之間。 我們選擇能夠在畢氏酵母中特異表達(dá)的載體pPIC9K，構(gòu)建了可以在E.coli和畢氏酵母GS115中表達(dá)的穿梭質(zhì)粒pPIC9K-Mx