補陽還五湯對PAF誘導的PC12細胞損傷的神經保護作用.pdf

1、腦血管疾病是危害人類生命與健康的常見病和多發(fā)病,是目前人類疾病的三大死亡因為之一,存活者中50％～70％病人遺留癱瘓、失語等嚴重殘疾,給社會和家庭帶來沉重的負擔。尋找新的治療方法已經成為當今神經科學領域的熱點。神經細胞是組成神經系統(tǒng)的基本功能單位,其正常的代謝活動的維持高度依賴于持續(xù)穩(wěn)定的血液供應。任何全身或局部因素使腦組織血流量降低至一定閾值時均可導致神經細胞損害。神經細胞的保護治療旨在提高神經細胞對任何因為引起的內環(huán)境紊亂的耐受力與

2、抵抗力,阻斷神經細胞壞死的不同環(huán)節(jié),使細胞在病理環(huán)境中的生存能力增強,促進神經細胞功能的恢復。隨著溶栓、抗凝等對急性缺血性腦卒中治療方法的確認,神經細胞保護越來越具有重要的臨床意義。
　　 血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF),是一種具有生物活性的脂質遞質,其誘導的血小板聚集過程不依賴于腺苷二磷酸(ADP)或花生四烯酸(AA)的代謝產物TXA2,被認為是誘導血小板聚集的第三條途徑。PAF

3、參與多種病理、生理過程,與血管內皮細胞、血小板等相互作用,在血栓形成過程中起著重要作用。它與缺血性腦血管病的關系越來越受到重視,從動脈硬化到中風恢復的各個環(huán)節(jié)上PAF都可能起重要作用。為了防治缺血性腦血管病,抑制PAF誘導的病理過程是必要的,其中一個重要的方法可能是PAF抑制劑的應用。
　　 現(xiàn)代醫(yī)學中的腦血管疾病,在祖國醫(yī)學中屬中風范疇。中醫(yī)藥治療中風歷史悠久,以整體觀念、辨證論治為基礎,對中風病的預防、治療、康復具有獨特理念

4、,積累了大量、豐富的理論知識和治療經驗。
　　 補陽還五湯出自清代名醫(yī)王清任的《醫(yī)林改錯》,由生黃芪、當歸尾、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花組成,是根據元氣虧虛、氣不能帥血行,發(fā)生血瘀而創(chuàng)制的補氣活血通絡方,具有補氣、活血、通絡之功,臨床廣泛用于治療或預防缺血性腦血管病、冠心病、心肌梗塞及其它血栓栓塞性疾病,是目前治療中風等血栓性疾病應用頻率最高的方劑。1999年開始實驗研究發(fā)現(xiàn)補陽還五湯具有神經保護作用,主要為對神經元缺氧凋亡的

5、保護作用,其藥物血清能夠促進周圍神經再生,可促進神經干細胞的生長、存活和向神經元及神經膠質細胞的分化,對常規(guī)和缺氧條件下神經元均有顯著的促細胞生長作用,促進胚胎神經上皮細胞的生長外,還可促其分化成神經元和神經膠質細胞的作用。目前中藥防治神經細胞損傷的研究已取得了一定的成績,為臨床防治神經細胞損傷積累了一定的理論基礎。我們課題前期也研究發(fā)現(xiàn)補陽還五湯可明顯改善脊髓損傷(SCI)大鼠后肢運動功能,減少SCI大鼠內源性PAF含量,發(fā)揮對損傷脊

6、髓的保護作用,其降低SCI大鼠血漿中PAF含量與改善其后肢運動功能相關。對損傷脊髓的保護作用可能與其能減少PAF-R數目,抑制PAF-R活性,從而阻斷PAF發(fā)揮損傷效應有關。
　　 由于神經細胞培養(yǎng)在缺血性腦損傷研究中的優(yōu)勢,如研究對象是活的神經細胞、研究的條件可以人為地控制、研究的神經細胞樣本可以達到比較均一性、研究的內容便于觀察、檢測和記錄,以及充分地滿足實驗的要求及研究費用較經濟等,因此利用神經細胞損傷的細胞模型在神經細胞

7、保護作用研究中顯得尤為重要。本研究結合缺血性神經損傷中已探明的病理生理機制,建立缺氧損傷神經細胞模型,觀察其對缺氧PC12細胞損傷模型細胞形態(tài)學、存活力及上清液中PAF含量的影響,探討補陽還五湯含藥血清對缺氧損傷PC12細胞的保護作用,為進一步研究該方神經細胞損傷保護作用,反映該方對神經細胞損傷過程的多環(huán)節(jié)干預,篩選出對神經細胞損傷有保護作用的有效成分提供實驗依據。
　　 目的:探討補陽還五湯含藥血清對缺氧損傷PC12細胞的保護

8、作用。
　　 方法:1、實驗動物、分組及模型建立:普通級新西蘭兔6只,隨機分為:正常組2只(蒸餾水組)、含藥血清組2只(補陽還五湯組)、陽性對照組2只(金納多組):每組動物分別給予相同體積10ml/kg灌服,1次/d,連續(xù)7 d。
　　 2、標本的采集及研究方法:末次給藥前禁食12 h,給藥2h后采血(耳中央動脈)制備含藥血清。將已80％融合的PC12細胞分為6組,補陽還五湯(BYHWD)含藥血清高劑量組(10％),補陽

9、還五湯(BYHWD)含藥血清低劑量組(2.5％),陽性對照組(金納多含藥血清5％),空白血清組(正常兔血清5%),模型組(無兔血清),正常組(正常培養(yǎng)含牛、馬血清各5％),按相應分組更換含藥血清培養(yǎng)基。將已分組加藥的PC12細胞置于37℃、5％CO2和90％氮氣的三氣培養(yǎng)箱內,制作缺氧模型。①PC12細胞形態(tài)學觀察,缺氧1.5h,3h,18h后,用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化,并用圖像采集系統(tǒng)進行拍攝；②缺氧造模18 h后,MTV法檢測

10、細胞存活力；③缺氧造模1.5 h后,Annexin V/PI檢測細胞凋亡率；④缺氧造模1.5 h后,酶聯(lián)免疫法(Elisa法)檢測培養(yǎng)上清PAF含量。
　　 結果:①對缺氧損傷PC12細胞形態(tài)學的影響:缺氧1.5h主要表現(xiàn)為急性損傷,與正常組相比,無論加藥與否,在形態(tài)學表現(xiàn)上,均有細胞排列紊亂,胞體形態(tài)變異,多不規(guī)則,部分連接斷裂,并伴部分脫壁,細胞間間隙變大。BYHWD組接近正常組細胞,缺氧18 h表現(xiàn)為細胞的自我修復,與模型

11、組相比,細胞生長密集,加藥各組均有不同程度的修復,胞體伸出突觸,較正常組稍粗短,胞體間重新建立連接,但較正常組稍紊亂,但BYHWD組與金納多組細胞形態(tài)接近正常組。②對缺氧損傷PC12細胞存活力的影響:各組細胞存活力相比有顯著的統(tǒng)計學意義(F=69.671,P=0.000)。模型組的存活力與正常組相比下降,差異有顯著性(P=0.000)；10％和2.5％BYHWD組存活力與模型組相比升高,差異有顯著性(P值均=0.000)；5％金納多組與

12、模型組比較,差異有顯著性(P=0.000)；10％BYHWD組和2.5％BYHWD組相比升高,差異有顯著性(P=0.000)。說明補陽還五湯高低劑量組均能提高缺氧損傷的PC12細胞的存活力,高劑量尤為顯著；③對缺氧損傷PC12細胞凋亡率的影響:結果表明,各組細胞凋亡率相比有顯著的統(tǒng)計學意義(F=20.740,P=0.000)。模型組的凋亡率與正常組相比升高,差異有顯著性(P=0.000)；10％和2.5％BYHWD組凋亡率與模型組相比下

13、降,差異有顯著性(P=0.000)；5％金納多組與模型組比較,差異有顯著性(P=0.000)；10％BYHWD組凋亡率比2.5％BYHWD組有下降趨勢,但兩組無差異(P=0.209)。說明補陽還五湯高低劑量組均能降低缺氧損傷的PC12細胞的凋亡率；④對細胞上清液中PAF含量的影響結果表明,各組細胞上清PAF含量相比有顯著的統(tǒng)計學意義(F=7.990,P=0.000)。模型組的PAF含量與正常組相比升高,差異有顯著性(P=0.000)；1

14、0％和2.5％BYHWD組PAF含量與模型組相比下降,差異有顯著性(P=0.000；P=0.004),與5％金納多組相比差異無顯著性(P=0.314；P=0.983),10％BYHWD組PAF含量比2.5％BYHWD組有下降趨勢,但兩組無差異(P=0.329)。說明補陽還五湯高、低劑量均能降低缺氧損傷的PC12細胞上清的PAF含量。
　　 結論:補陽還五湯含藥血清對缺氧損傷PC12細胞有明顯的保護作用,其機制與降低缺氧損傷細胞P