補陽還五湯對PAF誘導(dǎo)的PC12細胞損傷的神經(jīng)保護作用.pdf

1、腦血管疾病是危害人類生命與健康的常見病和多發(fā)病,是目前人類疾病的三大死亡因為之一,存活者中50％～70％病人遺留癱瘓、失語等嚴重殘疾,給社會和家庭帶來沉重的負擔(dān)。尋找新的治療方法已經(jīng)成為當(dāng)今神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的熱點。神經(jīng)細胞是組成神經(jīng)系統(tǒng)的基本功能單位,其正常的代謝活動的維持高度依賴于持續(xù)穩(wěn)定的血液供應(yīng)。任何全身或局部因素使腦組織血流量降低至一定閾值時均可導(dǎo)致神經(jīng)細胞損害。神經(jīng)細胞的保護治療旨在提高神經(jīng)細胞對任何因為引起的內(nèi)環(huán)境紊亂的耐受力與

2、抵抗力,阻斷神經(jīng)細胞壞死的不同環(huán)節(jié),使細胞在病理環(huán)境中的生存能力增強,促進神經(jīng)細胞功能的恢復(fù)。隨著溶栓、抗凝等對急性缺血性腦卒中治療方法的確認,神經(jīng)細胞保護越來越具有重要的臨床意義。
　　 血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF),是一種具有生物活性的脂質(zhì)遞質(zhì),其誘導(dǎo)的血小板聚集過程不依賴于腺苷二磷酸(ADP)或花生四烯酸(AA)的代謝產(chǎn)物TXA2,被認為是誘導(dǎo)血小板聚集的第三條途徑。PAF

3、參與多種病理、生理過程,與血管內(nèi)皮細胞、血小板等相互作用,在血栓形成過程中起著重要作用。它與缺血性腦血管病的關(guān)系越來越受到重視,從動脈硬化到中風(fēng)恢復(fù)的各個環(huán)節(jié)上PAF都可能起重要作用。為了防治缺血性腦血管病,抑制PAF誘導(dǎo)的病理過程是必要的,其中一個重要的方法可能是PAF抑制劑的應(yīng)用。
　　 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的腦血管疾病,在祖國醫(yī)學(xué)中屬中風(fēng)范疇。中醫(yī)藥治療中風(fēng)歷史悠久,以整體觀念、辨證論治為基礎(chǔ),對中風(fēng)病的預(yù)防、治療、康復(fù)具有獨特理念

4、,積累了大量、豐富的理論知識和治療經(jīng)驗。
　　 補陽還五湯出自清代名醫(yī)王清任的《醫(yī)林改錯》,由生黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花組成,是根據(jù)元氣虧虛、氣不能帥血行,發(fā)生血瘀而創(chuàng)制的補氣活血通絡(luò)方,具有補氣、活血、通絡(luò)之功,臨床廣泛用于治療或預(yù)防缺血性腦血管病、冠心病、心肌梗塞及其它血栓栓塞性疾病,是目前治療中風(fēng)等血栓性疾病應(yīng)用頻率最高的方劑。1999年開始實驗研究發(fā)現(xiàn)補陽還五湯具有神經(jīng)保護作用,主要為對神經(jīng)元缺氧凋亡的

5、保護作用,其藥物血清能夠促進周圍神經(jīng)再生,可促進神經(jīng)干細胞的生長、存活和向神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞的分化,對常規(guī)和缺氧條件下神經(jīng)元均有顯著的促細胞生長作用,促進胚胎神經(jīng)上皮細胞的生長外,還可促其分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的作用。目前中藥防治神經(jīng)細胞損傷的研究已取得了一定的成績,為臨床防治神經(jīng)細胞損傷積累了一定的理論基礎(chǔ)。我們課題前期也研究發(fā)現(xiàn)補陽還五湯可明顯改善脊髓損傷(SCI)大鼠后肢運動功能,減少SCI大鼠內(nèi)源性PAF含量,發(fā)揮對損傷脊

6、髓的保護作用,其降低SCI大鼠血漿中PAF含量與改善其后肢運動功能相關(guān)。對損傷脊髓的保護作用可能與其能減少PAF-R數(shù)目,抑制PAF-R活性,從而阻斷PAF發(fā)揮損傷效應(yīng)有關(guān)。
　　 由于神經(jīng)細胞培養(yǎng)在缺血性腦損傷研究中的優(yōu)勢,如研究對象是活的神經(jīng)細胞、研究的條件可以人為地控制、研究的神經(jīng)細胞樣本可以達到比較均一性、研究的內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄,以及充分地滿足實驗的要求及研究費用較經(jīng)濟等,因此利用神經(jīng)細胞損傷的細胞模型在神經(jīng)細胞

7、保護作用研究中顯得尤為重要。本研究結(jié)合缺血性神經(jīng)損傷中已探明的病理生理機制,建立缺氧損傷神經(jīng)細胞模型,觀察其對缺氧PC12細胞損傷模型細胞形態(tài)學(xué)、存活力及上清液中PAF含量的影響,探討補陽還五湯含藥血清對缺氧損傷PC12細胞的保護作用,為進一步研究該方神經(jīng)細胞損傷保護作用,反映該方對神經(jīng)細胞損傷過程的多環(huán)節(jié)干預(yù),篩選出對神經(jīng)細胞損傷有保護作用的有效成分提供實驗依據(jù)。
　　 目的:探討補陽還五湯含藥血清對缺氧損傷PC12細胞的保護

8、作用。
　　 方法:1、實驗動物、分組及模型建立:普通級新西蘭兔6只,隨機分為:正常組2只(蒸餾水組)、含藥血清組2只(補陽還五湯組)、陽性對照組2只(金納多組):每組動物分別給予相同體積10ml/kg灌服,1次/d,連續(xù)7 d。
　　 2、標(biāo)本的采集及研究方法:末次給藥前禁食12 h,給藥2h后采血(耳中央動脈)制備含藥血清。將已80％融合的PC12細胞分為6組,補陽還五湯(BYHWD)含藥血清高劑量組(10％),補陽

9、還五湯(BYHWD)含藥血清低劑量組(2.5％),陽性對照組(金納多含藥血清5％),空白血清組(正常兔血清5%),模型組(無兔血清),正常組(正常培養(yǎng)含牛、馬血清各5％),按相應(yīng)分組更換含藥血清培養(yǎng)基。將已分組加藥的PC12細胞置于37℃、5％CO2和90％氮氣的三氣培養(yǎng)箱內(nèi),制作缺氧模型。①PC12細胞形態(tài)學(xué)觀察,缺氧1.5h,3h,18h后,用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化,并用圖像采集系統(tǒng)進行拍攝；②缺氧造模18 h后,MTV法檢測

10、細胞存活力；③缺氧造模1.5 h后,Annexin V/PI檢測細胞凋亡率；④缺氧造模1.5 h后,酶聯(lián)免疫法(Elisa法)檢測培養(yǎng)上清PAF含量。
　　 結(jié)果:①對缺氧損傷PC12細胞形態(tài)學(xué)的影響:缺氧1.5h主要表現(xiàn)為急性損傷,與正常組相比,無論加藥與否,在形態(tài)學(xué)表現(xiàn)上,均有細胞排列紊亂,胞體形態(tài)變異,多不規(guī)則,部分連接斷裂,并伴部分脫壁,細胞間間隙變大。BYHWD組接近正常組細胞,缺氧18 h表現(xiàn)為細胞的自我修復(fù),與模型

11、組相比,細胞生長密集,加藥各組均有不同程度的修復(fù),胞體伸出突觸,較正常組稍粗短,胞體間重新建立連接,但較正常組稍紊亂,但BYHWD組與金納多組細胞形態(tài)接近正常組。②對缺氧損傷PC12細胞存活力的影響:各組細胞存活力相比有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(F=69.671,P=0.000)。模型組的存活力與正常組相比下降,差異有顯著性(P=0.000)；10％和2.5％BYHWD組存活力與模型組相比升高,差異有顯著性(P值均=0.000)；5％金納多組與

12、模型組比較,差異有顯著性(P=0.000)；10％BYHWD組和2.5％BYHWD組相比升高,差異有顯著性(P=0.000)。說明補陽還五湯高低劑量組均能提高缺氧損傷的PC12細胞的存活力,高劑量尤為顯著；③對缺氧損傷PC12細胞凋亡率的影響:結(jié)果表明,各組細胞凋亡率相比有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(F=20.740,P=0.000)。模型組的凋亡率與正常組相比升高,差異有顯著性(P=0.000)；10％和2.5％BYHWD組凋亡率與模型組相比下

13、降,差異有顯著性(P=0.000)；5％金納多組與模型組比較,差異有顯著性(P=0.000)；10％BYHWD組凋亡率比2.5％BYHWD組有下降趨勢,但兩組無差異(P=0.209)。說明補陽還五湯高低劑量組均能降低缺氧損傷的PC12細胞的凋亡率；④對細胞上清液中PAF含量的影響結(jié)果表明,各組細胞上清PAF含量相比有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.990,P=0.000)。模型組的PAF含量與正常組相比升高,差異有顯著性(P=0.000)；1

14、0％和2.5％BYHWD組PAF含量與模型組相比下降,差異有顯著性(P=0.000；P=0.004),與5％金納多組相比差異無顯著性(P=0.314；P=0.983),10％BYHWD組PAF含量比2.5％BYHWD組有下降趨勢,但兩組無差異(P=0.329)。說明補陽還五湯高、低劑量均能降低缺氧損傷的PC12細胞上清的PAF含量。
　　 結(jié)論:補陽還五湯含藥血清對缺氧損傷PC12細胞有明顯的保護作用,其機制與降低缺氧損傷細胞P