補陽還五湯對缺氧損傷神經(jīng)干細胞BDNF、GDNF表達的影響.pdf

1、目的:觀察補陽還五湯對缺氧損傷神經(jīng)干細胞BDNF、GDNF表達的影響。
　　方法:⑴將原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞，隨機分為4組：空白組、模型組、補陽還五湯血清組、正常血清對照組，于培養(yǎng)的第2天，取四組培養(yǎng)細胞各12孔，每孔加入4％多聚甲醛室溫下固定30min，3%H2O2-0.1M PBS20min以去除內(nèi)源性過氧化物酶，正常羊血清封閉，37℃孵育1h。將四組各12孔細胞進一步分成二個亞組，每個亞組六孔細胞，分別加入一抗(BDNF、GD

2、NF)，37℃孵育1h，經(jīng)生物素化二抗和辣根酶標記鏈酶親和素各1h(37℃) DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，蒸餾水洗三次終止反應(yīng)。以上操作除滴加封閉液后勿洗外，其它各步驟之間均須用0.1M PBS(含0.3%TritonX-100)洗5min×3次。在40倍物鏡下觀察缺氧損傷后神經(jīng)干細胞的形態(tài)變化以及免疫反應(yīng)陽性物的分布。對于陽性反應(yīng)物的水平，則按每組6孔細胞，每孔細胞取5個互不重疊的視野，計算每個視野的陽性細胞數(shù)目。并用南京捷達DP8

3、01圖像分析系統(tǒng)，分別統(tǒng)計BDNF和GDNF蛋白表達的陽性面積，取平均值。并進行統(tǒng)計學分析。
　　結(jié)果:補陽還五湯血清干預(yù)1 d后Nestin、NF-200、GFAP單標免疫細胞化學發(fā)現(xiàn)NF-200陽性細胞比例中實驗組最高(66±7)％，與空白組和對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0．05)。補陽還五湯血清組BDNF