補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)雪旺細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：長(zhǎng)期以來(lái)，周圍神經(jīng)病變嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量，是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域中的一個(gè)十分復(fù)雜的病變過(guò)程，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機(jī)理之一為氧化應(yīng)激引起氧自由基增多，從而導(dǎo)致雪旺細(xì)胞的凋亡。雪旺細(xì)胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)特有的一種膠質(zhì)細(xì)胞，能包繞軸突形成或不形成髓鞘，并分泌多種與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和再生有密切關(guān)系的神經(jīng)因子。近些年來(lái)，應(yīng)用外界因素(如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、中藥、電磁場(chǎng)、硅膠管及其它物質(zhì)的移植等)通過(guò)對(duì)體內(nèi)雪旺細(xì)胞的作用進(jìn)而治療周圍神經(jīng)損傷的研究日漸增多

2、。 中藥對(duì)周圍神經(jīng)的作用，一直是我國(guó)醫(yī)療工作者和科研工作者研究的熱點(diǎn)，中藥促進(jìn)周圍神經(jīng)再生已經(jīng)得到人們的廣泛認(rèn)可。補(bǔ)陽(yáng)還五湯是清代名醫(yī)王清任創(chuàng)制的補(bǔ)氣活血名方，由黃芪、赤芍、當(dāng)歸、地龍、川芎、桃仁和紅花組或，對(duì)于腦中風(fēng)等疾病有良好的治療效果，近年來(lái)此方用于治療周圍神經(jīng)病變，可改善、消除臨床癥狀?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，它不僅具有擴(kuò)張血管、增加腦血流量、改善微循環(huán)的作用，還有抗自由基氧化損傷作用。在我們以往的在體實(shí)驗(yàn)研究中，已證實(shí)了補(bǔ)陽(yáng)

3、還五湯能促進(jìn)坐骨神經(jīng)損傷后的結(jié)構(gòu)修復(fù)和功能恢復(fù)，并且觀察到再生神經(jīng)有髓纖維多且結(jié)構(gòu)成熟，血管含量也比對(duì)照組明顯多，提示了補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)雪旺細(xì)胞有一定的促進(jìn)作用。關(guān)于補(bǔ)陽(yáng)還五湯的抗氧化作用已有初步研究，但對(duì)雪旺細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用的機(jī)理尚未見報(bào)道。 本課題通過(guò)建立過(guò)氧化氫誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞氧化損傷的模型，并在此模型的基礎(chǔ)上，觀察補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)氧化損傷的雪旺細(xì)胞的保護(hù)作用。通過(guò)MTT、生化檢測(cè)、免疫組化、RT-PCR測(cè)定、激光掃描共聚焦顯微鏡

4、進(jìn)行熒光定量分析等方法進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定、酶活力分析、細(xì)胞內(nèi)蛋白含量、GDNFmRNA表達(dá)水平及鈣離子濃度定量測(cè)定等，探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗氧化損傷的作用機(jī)理，為更好的指導(dǎo)臨床用藥提供理論依據(jù)。 方法：本課題從Wistar新生大鼠的坐骨神經(jīng)和正中神經(jīng)取材，進(jìn)行體外培養(yǎng)雪旺細(xì)胞。培養(yǎng)48小時(shí)后，分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，另設(shè)一空白對(duì)照組。 1.補(bǔ)陽(yáng)還五湯提取液的制備：補(bǔ)陽(yáng)還五湯由黃芩60克，當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花、地龍、赤勺各10克組成，用

5、水煎醇沉法(75％乙醇)提取，生藥含量為2g/ml，4℃保存，在使用時(shí)過(guò)濾除菌。 2.雪旺細(xì)胞的純化及鑒定：加入阿糖胞苷以去除成纖維細(xì)胞，在培養(yǎng)3d時(shí)做S-100蛋白免疫組化染色，鑒定雪旺細(xì)胞。 3.氧化損傷及藥物處理：細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)分三組：過(guò)氧化氫損傷組：H2O2終濃度為0.5％；補(bǔ)陽(yáng)還五湯保護(hù)組：0.5％H2O2+600μg/ml補(bǔ)陽(yáng)還五湯提取液；正常組(不加任何因素)；同時(shí)設(shè)僅加培養(yǎng)液的空白對(duì)照組。 4.MTT

6、法進(jìn)行補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗過(guò)氧化氫氧化損傷的作用分析。 5.生化檢測(cè)法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA和超氧化物歧化酶SOD水平的檢測(cè)。 6.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，對(duì)過(guò)氧化氫損傷組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯保護(hù)組及正常對(duì)照組三組細(xì)胞進(jìn)行Caspase-3蛋白酶變化的測(cè)定。 7.Fluo-3/Am對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光染色后，應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度變化進(jìn)行圖像采集及定量分析。 8.正常對(duì)照組、過(guò)氧化氫損傷組及

7、補(bǔ)陽(yáng)還五湯保護(hù)組用RT-PCR法檢測(cè)GDNFmRNA的表達(dá)變化情況。 通過(guò)以上的實(shí)驗(yàn)，建立過(guò)氧化氫誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞的氧化損傷模型，在此模型的基礎(chǔ)上探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)雪旺細(xì)胞抗氧化保護(hù)作用的機(jī)理。 結(jié)果：剛接種的原代雪旺細(xì)胞呈圓形，懸浮在培養(yǎng)液中，次日觀察可見絕大多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)貼壁，胞體較小，呈梭形，飽滿立體感強(qiáng)，有兩個(gè)細(xì)長(zhǎng)的突起，在培養(yǎng)24小時(shí)后加終濃度為10-5mol/L的阿糖胞苷，48小時(shí)后換液去除阿糖胞苷后，鏡下觀察免疫化

8、學(xué)染色顯示80％以上的細(xì)胞S-100呈陽(yáng)性反應(yīng)。加入H2O212小時(shí)后，在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞突起萎縮，胞體腫脹變圓，細(xì)胞數(shù)量減少，部分細(xì)胞脫壁漂浮于培養(yǎng)液中，胞體立體感差，折光度下降，并可見大量細(xì)胞碎片；補(bǔ)陽(yáng)還五湯保護(hù)組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，胞體飽滿立體感強(qiáng)，少見細(xì)胞皺縮破碎現(xiàn)象，但細(xì)胞聚團(tuán)現(xiàn)象較明顯;正常組細(xì)胞狀態(tài)長(zhǎng)勢(shì)很好。 不同實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)結(jié)果如下： 1.MTT法進(jìn)行補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗氧化損傷的作用分析

9、表明：補(bǔ)陽(yáng)還五湯可明顯拮抗過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化損傷，與過(guò)氧化氫損傷組相比，補(bǔ)陽(yáng)還五湯保護(hù)組可維持較高的細(xì)胞存活率，二者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；補(bǔ)陽(yáng)還五湯保護(hù)組細(xì)胞存活率雖然低于正常組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.生化檢測(cè)表明：與損傷組相比，補(bǔ)陽(yáng)還五湯保護(hù)組能使細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)維持于較高的活力水平，表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯可明顯拮抗過(guò)氧化氫引起的SOD降低；同時(shí)低于正常對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 3.生化

10、檢測(cè)表明：與正常組相比，過(guò)氧化氫引起細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物的大量堆積，而補(bǔ)陽(yáng)還五湯可明顯降低細(xì)胞中過(guò)氧化物的含量(P＜0.05)。 4.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Caspase-3蛋白酶：過(guò)氧化氫損傷組Caspase-3呈強(qiáng)陽(yáng)性，而補(bǔ)陽(yáng)還五湯保護(hù)組Caspase-3呈弱陽(yáng)性，正常組幾乎無(wú)著色。 5.激光掃描共聚焦顯微鏡分析細(xì)胞中鈣離子濃度變化：過(guò)氧化氫損傷組細(xì)胞中鈣離子濃度顯著升高，熒光強(qiáng)度明顯較強(qiáng)；而補(bǔ)陽(yáng)還五湯保護(hù)組和正常組細(xì)胞中

11、鈣離子著色的熒光強(qiáng)度較接近且明顯較弱。 6.RT-PCR檢測(cè)GDNFmRNA表達(dá)情況：過(guò)氧化氫損傷組細(xì)胞中GDNFmRNA表達(dá)量很少，而補(bǔ)陽(yáng)還五湯保護(hù)組GDNFmRNA表達(dá)量要高于損傷組(P＜0.05)，正常組的表達(dá)量最高。 結(jié)論：我們以原代培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，在過(guò)氧化氫誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞的氧化損傷模型的基礎(chǔ)上，觀察過(guò)氧化氫誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞的氧化損傷及補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)氧化損傷的雪旺細(xì)胞的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：過(guò)氧化氫損傷能夠引

12、起細(xì)胞內(nèi)自由基增多，SOD活力降低，脂質(zhì)過(guò)氧化物增多，并且自由基的增多能通過(guò)信號(hào)通路上Caspase-3最終引起細(xì)胞的凋亡;補(bǔ)陽(yáng)還五湯則能夠降低細(xì)胞內(nèi)MDA脂質(zhì)氧化物含量，維持超氧化物歧化酶含量，還能通過(guò)降低鈣離子濃度及凋亡蛋白酶Caspase-3來(lái)影響死亡事件的發(fā)生，證明補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以明顯拮抗過(guò)氧化氫對(duì)雪旺細(xì)胞的氧化損傷。 本研究是補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)雪旺細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究，從氧化損傷信號(hào)傳導(dǎo)通路方面來(lái)探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯的