補陽還五湯對雪旺細胞氧化損傷保護作用機理的實驗研究.pdf

1、目的：長期以來，周圍神經(jīng)病變嚴重影響著人們的生活質量，是神經(jīng)科學領域中的一個十分復雜的病變過程，近年來的研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機理之一為氧化應激引起氧自由基增多，從而導致雪旺細胞的凋亡。雪旺細胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)特有的一種膠質細胞，能包繞軸突形成或不形成髓鞘，并分泌多種與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和再生有密切關系的神經(jīng)因子。近些年來，應用外界因素(如神經(jīng)生長因子、中藥、電磁場、硅膠管及其它物質的移植等)通過對體內雪旺細胞的作用進而治療周圍神經(jīng)損傷的研究日漸增多

2、。 中藥對周圍神經(jīng)的作用，一直是我國醫(yī)療工作者和科研工作者研究的熱點，中藥促進周圍神經(jīng)再生已經(jīng)得到人們的廣泛認可。補陽還五湯是清代名醫(yī)王清任創(chuàng)制的補氣活血名方，由黃芪、赤芍、當歸、地龍、川芎、桃仁和紅花組或，對于腦中風等疾病有良好的治療效果，近年來此方用于治療周圍神經(jīng)病變，可改善、消除臨床癥狀?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，它不僅具有擴張血管、增加腦血流量、改善微循環(huán)的作用，還有抗自由基氧化損傷作用。在我們以往的在體實驗研究中，已證實了補陽

3、還五湯能促進坐骨神經(jīng)損傷后的結構修復和功能恢復，并且觀察到再生神經(jīng)有髓纖維多且結構成熟，血管含量也比對照組明顯多，提示了補陽還五湯對雪旺細胞有一定的促進作用。關于補陽還五湯的抗氧化作用已有初步研究，但對雪旺細胞氧化損傷保護作用的機理尚未見報道。 本課題通過建立過氧化氫誘導雪旺細胞氧化損傷的模型，并在此模型的基礎上，觀察補陽還五湯對氧化損傷的雪旺細胞的保護作用。通過MTT、生化檢測、免疫組化、RT-PCR測定、激光掃描共聚焦顯微鏡

4、進行熒光定量分析等方法進行細胞活力測定、酶活力分析、細胞內蛋白含量、GDNFmRNA表達水平及鈣離子濃度定量測定等，探討補陽還五湯抗氧化損傷的作用機理，為更好的指導臨床用藥提供理論依據(jù)。 方法：本課題從Wistar新生大鼠的坐骨神經(jīng)和正中神經(jīng)取材，進行體外培養(yǎng)雪旺細胞。培養(yǎng)48小時后，分為3個實驗組，另設一空白對照組。 1.補陽還五湯提取液的制備：補陽還五湯由黃芩60克，當歸、川芎、桃仁、紅花、地龍、赤勺各10克組成，用

5、水煎醇沉法(75％乙醇)提取，生藥含量為2g/ml，4℃保存，在使用時過濾除菌。 2.雪旺細胞的純化及鑒定：加入阿糖胞苷以去除成纖維細胞，在培養(yǎng)3d時做S-100蛋白免疫組化染色，鑒定雪旺細胞。 3.氧化損傷及藥物處理：細胞培養(yǎng)時分三組：過氧化氫損傷組：H2O2終濃度為0.5％；補陽還五湯保護組：0.5％H2O2+600μg/ml補陽還五湯提取液；正常組(不加任何因素)；同時設僅加培養(yǎng)液的空白對照組。 4.MTT

6、法進行補陽還五湯抗過氧化氫氧化損傷的作用分析。 5.生化檢測法進行細胞內脂質過氧化物MDA和超氧化物歧化酶SOD水平的檢測。 6.應用免疫組織化學方法，對過氧化氫損傷組、補陽還五湯保護組及正常對照組三組細胞進行Caspase-3蛋白酶變化的測定。 7.Fluo-3/Am對細胞進行熒光染色后，應用激光掃描共聚焦顯微鏡對不同實驗組細胞內鈣離子的濃度變化進行圖像采集及定量分析。 8.正常對照組、過氧化氫損傷組及

7、補陽還五湯保護組用RT-PCR法檢測GDNFmRNA的表達變化情況。 通過以上的實驗，建立過氧化氫誘導雪旺細胞的氧化損傷模型，在此模型的基礎上探討補陽還五湯對雪旺細胞抗氧化保護作用的機理。 結果：剛接種的原代雪旺細胞呈圓形，懸浮在培養(yǎng)液中，次日觀察可見絕大多數(shù)細胞已經(jīng)貼壁，胞體較小，呈梭形，飽滿立體感強，有兩個細長的突起，在培養(yǎng)24小時后加終濃度為10-5mol/L的阿糖胞苷，48小時后換液去除阿糖胞苷后，鏡下觀察免疫化

8、學染色顯示80％以上的細胞S-100呈陽性反應。加入H2O212小時后，在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞的形態(tài)發(fā)生改變，細胞突起萎縮，胞體腫脹變圓，細胞數(shù)量減少，部分細胞脫壁漂浮于培養(yǎng)液中，胞體立體感差，折光度下降，并可見大量細胞碎片；補陽還五湯保護組細胞生長狀態(tài)良好，胞體飽滿立體感強，少見細胞皺縮破碎現(xiàn)象，但細胞聚團現(xiàn)象較明顯;正常組細胞狀態(tài)長勢很好。 不同實驗組檢測結果如下： 1.MTT法進行補陽還五湯抗氧化損傷的作用分析

9、表明：補陽還五湯可明顯拮抗過氧化氫誘導的氧化損傷，與過氧化氫損傷組相比，補陽還五湯保護組可維持較高的細胞存活率，二者之間有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；補陽還五湯保護組細胞存活率雖然低于正常組，但無統(tǒng)計學意義。 2.生化檢測表明：與損傷組相比，補陽還五湯保護組能使細胞內超氧化物歧化酶(SOD)維持于較高的活力水平，表明補陽還五湯可明顯拮抗過氧化氫引起的SOD降低；同時低于正常對照組，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 3.生化

10、檢測表明：與正常組相比，過氧化氫引起細胞內脂質過氧化物的大量堆積，而補陽還五湯可明顯降低細胞中過氧化物的含量(P＜0.05)。 4.免疫組織化學法檢測Caspase-3蛋白酶：過氧化氫損傷組Caspase-3呈強陽性，而補陽還五湯保護組Caspase-3呈弱陽性，正常組幾乎無著色。 5.激光掃描共聚焦顯微鏡分析細胞中鈣離子濃度變化：過氧化氫損傷組細胞中鈣離子濃度顯著升高，熒光強度明顯較強；而補陽還五湯保護組和正常組細胞中

11、鈣離子著色的熒光強度較接近且明顯較弱。 6.RT-PCR檢測GDNFmRNA表達情況：過氧化氫損傷組細胞中GDNFmRNA表達量很少，而補陽還五湯保護組GDNFmRNA表達量要高于損傷組(P＜0.05)，正常組的表達量最高。 結論：我們以原代培養(yǎng)的雪旺細胞為實驗材料，在過氧化氫誘導雪旺細胞的氧化損傷模型的基礎上，觀察過氧化氫誘導雪旺細胞的氧化損傷及補陽還五湯對氧化損傷的雪旺細胞的保護作用。實驗結果顯示：過氧化氫損傷能夠引

12、起細胞內自由基增多，SOD活力降低，脂質過氧化物增多，并且自由基的增多能通過信號通路上Caspase-3最終引起細胞的凋亡;補陽還五湯則能夠降低細胞內MDA脂質氧化物含量，維持超氧化物歧化酶含量，還能通過降低鈣離子濃度及凋亡蛋白酶Caspase-3來影響死亡事件的發(fā)生，證明補陽還五湯可以明顯拮抗過氧化氫對雪旺細胞的氧化損傷。 本研究是補陽還五湯對雪旺細胞氧化損傷保護作用機理的實驗研究，從氧化損傷信號傳導通路方面來探討補陽還五湯的