HUVEC疫苗抗人食管鱗癌腫瘤血管生成的研究.pdf

1、由于飲食習慣、生活環(huán)境以及遺傳等因素，我國成為食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家。雖然手術、放療和化療廣泛應用于食管癌的治療，但食管癌治療后的五年總生存率依然小于20％。因此，我們需要研究新的策略來治療食管癌。研究發(fā)現(xiàn)當腫瘤直徑生長到1-2 mm的時候，腫瘤的生長必須通過刺激新生血管的生成，來滿足其對氧氣和營養(yǎng)成分的需求。因此，通過抑制腫瘤新生血管的生成來抑制腫瘤的生長，成為當前另外一種腫瘤免疫治療的新策略。目前已知的和腫瘤血管生成相關的因

2、子有30多種，通過抑制相關的通路和因子來阻斷腫瘤血管生成，也取得了一定的效果。2003年貝伐單抗(Bevacizumab)成為第一個被FDA批準的用于腫瘤血管生成抑制劑，隨后抗血管生成單克隆抗體逐漸應用于臨床。但是腫瘤血管生成的方式多樣，信號通路復雜，使目前針對單一靶點的藥物治療效果非常有限。
　　腫瘤免疫治療是通過激發(fā)和增強機體抗腫瘤免疫應答，調動宿主的天然防御機制，從而達到控制和殺滅腫瘤細胞的一種新的治療方法，逐漸成為繼手術、

3、放化療之后又一種腫瘤治療的重要手段。腫瘤組織新生血管的內皮細胞處于十分活躍的增殖狀態(tài)，而正常組織血管內皮細胞一般處于靜止狀態(tài)。以腫瘤血管內皮細胞為靶點的主動免疫治療，靶向腫瘤血管內皮細胞增殖的多個抗原，產(chǎn)生綜合抑制腫瘤血管生成的效果。人臍靜脈內皮細胞（Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）是增殖旺盛的內皮細胞，高表達內皮細胞增殖的相關抗原，與體內增殖活躍的腫瘤血管內皮細胞表達一些相同的血

4、管內皮細胞增殖相關抗原。以HUVEC細胞制備疫苗，靶向多個腫瘤血管增殖的相關抗原，產(chǎn)生綜合抑制腫瘤血管生成的效果。本研究構建了人源化的 NOD/SCID小鼠食管癌移植瘤模型，探討HUVEC疫苗對人食管癌的抗腫瘤血管生成作用，為抗腫瘤血管生成免疫治療提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.通過對24只NOD/SCID小鼠眼眶后叢靜脈取血，獲得血清。利用ELISA法檢測NOD/SCID小鼠外周血血清中IgG蛋白含量，檢測小鼠是否發(fā)生“免

5、疫滲漏”現(xiàn)象，并利用標準曲線計算所有小鼠血清中的IgG蛋白含量。
　　2.利用密度梯度離心法分離出人外周血的單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，然后對NOD/SCID小鼠腹腔注射PBMC(4×106個/只)進行免疫重建。4周之后，獲得小鼠外周血，通過流式細胞儀檢測小鼠外周血中人的CD45+T淋巴細胞表達情況。
　　3.將免疫重建成功的小鼠隨機分為2組，一組為PBMC+

6、HUVEC組(n=8)，在小鼠左側腋窩淋巴結周圍注射HUVEC疫苗進行免疫(5×106個/只)，1次/周，一共5次，刺激機體免疫能力的增強；另外一組為PBMC組（n=8）小鼠注射PBS。未免疫重建的小鼠（n=8）作為空白對照組注射PBS。一共3組進行本次實驗。
　　4.對PBS組小鼠(n=8)、PBMC組(n=8)和PBMC+ HUVEC組(n=8)小鼠分別在背部皮下接種人食管鱗癌細胞EC9706(6×106個/只)，待成瘤之后隔

7、天測量，觀察腫瘤的大小，成瘤后測量至第28天處死，得到腫瘤組織，稱重并拍照。分別取3組小鼠的血清用ELISA法進行抗HUVEC抗體效價檢測，測量450 nm的OD值檢測小鼠血清中抗腫瘤血管內皮細胞抗體生成情況。隨后，通過血紅蛋白測定實驗，將小鼠腫瘤組織研磨，并利用試劑盒在540 nm檢測腫瘤組織研磨物上清中血紅蛋白的濃度；將小鼠腫瘤組織用中性甲醛固定，石蠟包塊，然后利用免疫組織化學技術，孵育抗體CD31，然后用DAB顯色液染色，檢查腫瘤

8、組織中CD31的表達，以檢測腫瘤組織新生血管的生成情況。
　　5.剝離小鼠脾臟組織，稱重并拍照；將小鼠脾臟組織研磨，過濾并用紅細胞裂解液裂解紅細胞，淋巴細胞分離液分離得到淋巴細胞。通過流式細胞儀檢測3組小鼠等質量脾臟組織中CD45+T淋巴細胞的表達情況。提取腫瘤組織的RNA，并用Q-PCR的方法測定腫瘤組織中VEGFR2和CD144基因的表達情況；提取腫瘤組織的蛋白，用Western blot檢測腫瘤組織VEGFR2和CD144抗

9、原的表達。運用Western blot檢測3組小鼠血清中抗VEGFR2和CD144抗體的表達情況，以及ELISA法檢測3組小鼠血清抗HUVEC抗體的能力，來探索HUVEC疫苗抑制腫瘤血管生成的原因。
　　結果：
　　1.通過ELISA試劑盒對小鼠外周血中的小鼠IgG含量的檢測，結合CurveExpert軟件得到的標準曲線，計算得到小鼠外周血中的IgG含量都小于2 ng/ml，遠遠小于1μg/ml的標準；所有小鼠在后天環(huán)境的飼

10、養(yǎng)中未發(fā)生“免疫滲漏”。
　　2.流式細胞術分析免疫重建4周小鼠外周血中CD45+T淋巴細胞的表達量，結果顯示CD45+T淋巴細胞＞0.1%，證明免疫重建成功。
　　3.剝離小鼠腫瘤后稱量，3組小鼠腫瘤組織的重量分別是PBS組＞PBMC組＞PBMC+ HUVEC組(p＜0.01)；三組小鼠血清抗 HUVEC抗體效價：PBS組＜PBMC組＜PBMC+ HUVEC組(p＜0.05)；腫瘤組織血紅蛋白含量：PBS組＞PBMC組＞P

11、BMC+HUVEC組(p＜0.05)；免疫組化檢測腫瘤組織切片腫瘤微血管密度：PBS組＞PBMC組＞PBMC+HUVEC組(p＜0.05)。
　　4.剝離小鼠脾臟后稱量，3組小鼠脾臟組織的重量分別是PBS組＜PBMC組＜PBMC+HUVEC組(p＜0.05)；流式細胞術檢測16周3組小鼠脾臟分離得到的淋巴細胞和外周血中 CD45+T淋巴細胞表達量：PBS組＜PBMC組＜PBMC+HUVEC組(p＜0.001)。
　　5. Q

12、-PCR檢測腫瘤組織中CD144和VEGFR2基因的表達情況：PBS組＞PBMC組＞PBMC+HUVEC組(p＜0.05)；腫瘤組織提取蛋白檢測VEGFR2和CD144的抗原表達情況：PBS組＞PBMC組＞PBMC+ HUVEC組(p＜0.05)，血清中VEGFR2和CD144抗體的表達情況：PBS組＜PBMC組＜PBMC+HUVEC組(p＜0.001)；ELISA檢測三組小鼠血清中的抗HUVEC抗體的抗性：PBS組＜PBMC組＜PBM