胃癌微環(huán)境差異蛋白質篩選及表達機制.pdf

1、目的：胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。本研究旨在尋找胃癌微環(huán)境中差異蛋白質分子，并探討其表達調控的機制，揭示微環(huán)境在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。
　　方法：
　　1.采用激光捕獲顯微切割（LCM）技術，分別切取新鮮正常胃粘膜組織（NGM）和胃腺癌組織（GAC）中間質，獲取高純度的NGM和GAC間質總蛋白質，同位素標記（iTRAQ），結合二維液相色譜聯(lián)用質譜（2D LC-MS/MS）技術，鑒定NGM和GAC間微環(huán)境中的差異表達蛋

2、白質分子。通過生物信息學方法，分析胃癌微環(huán)境蛋白質分子間的相互作用。選取胃癌間質中高表達蛋白質（FN1和MCL1）和低表達蛋白質（EMILIN1和COL1A1），運用Western blot和免疫組織化學染色方法，驗證NGM及GAC組織中蛋白質組學實驗結果，分析GAC間質差異表達蛋白質分子的臨床病理學意義。
　　2.蛋白質組學實驗結果，經(jīng)生物信息軟件分析，篩尋調控GAC間質差異蛋白質分子表達的miRNAs。選取其中的miR-125

3、b進行研究，采用qRT-PCR和原位雜交技術，檢測miR-125b在NGM和GAC組織中的表達，分析miR-125b表達與胃癌患者臨床病理及預后的關系；將miR-125b轉染于胃癌MGC-803細胞，通過細胞生長曲線繪制、Transwell侵襲、流式細胞儀、Western blot及裸鼠成瘤，分析miR-125b導入MGC-803細胞，對MGC-803細胞生長增殖、凋亡及侵襲的影響。Targetscan6.2軟件分析，預測miR-125

4、b可能參與調控胃癌的靶基因；采用熒光素酶基因報告檢測、qRT-PCR與Western blot方法，證實MCL1基因為miR-125b調控的靶基因；免疫組織化學染色，觀察注射miR-125b，荷瘤組織中MCL1表達水平；構建MCL1 干擾載體，采用生長曲線繪制、Transwell侵襲實驗、流式細胞
　　儀與Western blot，觀察敲低MCL1基因表達，對MGC-803細胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響。
　　結果

5、：
　　1.本研究在胃癌間質中總共鑒定出差異蛋白質分子123個，其中表達上調56個，下調67個，這些蛋白質涉及腫瘤相關的信號通路（如MAPK信號通路、VEF信號通路、p53信號通路等）、器官發(fā)育、細胞生長、增殖、凋亡、代謝、激應、運輸及免疫等；部分蛋白質在STRING網(wǎng)絡中呈現(xiàn)相互節(jié)點，兩兩間相互聯(lián)系；免疫組織化學染色結果顯示，EMILIN1和COL1A1蛋白質在胃癌組織中低表達，而MCL1和FN1蛋白質則在胃癌組織中高表達。MC

6、L1和FN1在胃癌中高表達，與胃癌分化程度、腫塊大小、淋巴結轉移及TNM分期呈正相關，與EMILIN1和COL1A1表達則呈負相關（P<0.01）。
　　2.通過生物信息學軟件，預測調控胃癌微環(huán)境差異蛋白質分子的micRNAs，分析顯示miR-125b調控多個蛋白質；miR-125b在胃癌組織中低表達，其表達與胃癌組織的分化程度呈正相關（P<0.01）；miR-125b在TNM分期I-II期患者的陽性表達率高于III-IV期患者，

7、與胃癌患者TNM分期呈負相關（P<0.01）；miR-125b表達與胃癌淋巴結轉移呈負相關（ P<0.01）；Kaplan-meier生存曲線分析顯示，miR-125b表達胃癌患者生存期相關，miR-125b高表達患者生存期長于miR-125b低表達組，miR-125b表達低，患者預后差（P<0.01）。
　　3.miR-125b導入MGC-803細胞，細胞生長速度減慢，侵襲能力降低，細胞凋亡率增加，Cleaved caspase

8、-3及Cleaved PARP表達增加（P<0.01），裸鼠荷瘤體積變小、重量減輕（P<0.01）；MCL1是miR-125b的靶基因，核苷酸結合位點是 MCL1基因3’UTR的2613-2620；miR-125b高表達，MGC-803細胞 MCL1基因表達降低（P<0.01）；敲低MCL1基因在MGC-803細胞的表達，細胞生長速度減慢，侵襲能力降低，細胞凋亡增加，Cleaved caspase-3及Cleaved PARP表達增加（

9、P<0.01）；注射miR-125b，可抑制裸鼠荷瘤生長，荷瘤組織內MCL1蛋白質的表達降低（P<0.01）。
　　結論：
　　1.篩選胃癌微環(huán)境差異表達蛋白質123個，其中上調56個，下調67個。
　　2.miR-125b在胃癌組織中低表達，其表達水平與胃癌分化程度、TNM分期、淋巴結轉移及患者預后相關。
　　3.miR-125b可抑制MCL1基因表達，活化Caspase-3信號通路，降低MGC803細胞增殖與