siRNA抑制ZNF139前后胃癌BGC823細(xì)胞差異蛋白質(zhì)的篩選與鑒定.pdf

1、目的:胃癌是全球第二大癌癥致死性疾病，尤以中國(guó)等其他東亞國(guó)家高發(fā)。盡管世界各國(guó)的學(xué)者在對(duì)胃癌的發(fā)生發(fā)展和診斷治療的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多胃癌相關(guān)基因和蛋白，但是仍然沒(méi)有全面的揭示胃黏膜細(xì)胞的惡化、增殖凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等機(jī)制。有研究表明，人鋅指蛋白(zincfingerprotein，ZNF)家族基因在多種腫瘤如乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌等的發(fā)生和腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及多藥耐藥有關(guān)。鋅指蛋白139(zincfingerprotein1

2、39，ZNF139)基因編碼表達(dá)鋅指蛋白亞科KRAB的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，該蛋白含有重復(fù)的與保守序列相連接的Cys2-His2(C2H2)鋅指結(jié)構(gòu)域，而這種結(jié)構(gòu)被認(rèn)為與特異的DNA調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄、參與RNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、介導(dǎo)蛋白質(zhì)間相互作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)ZNF139的異常表達(dá)與胃癌的分化密切相關(guān)，但ZNF139與胃癌的發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制之間的關(guān)系尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)用ZNF139特異性siRNA轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株BGC823，研究被抑制后ZN

3、F139基因mRNA的表達(dá)，并依靠蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步探討ZNF139基因被抑制前后胃癌細(xì)胞差異表達(dá)的蛋白質(zhì)及其生物學(xué)功能。
　　 方法:
　　 1.用含有ZNF139特異性siRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞BGC823抑制ZNF139基因的表達(dá)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后BGC823細(xì)胞內(nèi)ZNF139mRNA表達(dá)變化情況。
　　 2.培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株BGC823，通過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞抑

4、制ZNF139基因的表達(dá)，應(yīng)用雙向差異凝膠電泳分離、篩選轉(zhuǎn)染前后BGC823細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，然后用液相質(zhì)譜—色譜技術(shù)鑒定并用生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)分類相關(guān)蛋白質(zhì)。
　　 3.采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（Westernblot）驗(yàn)證鑒定出的蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)染前后胃癌細(xì)胞中表達(dá)量與蛋白質(zhì)組學(xué)方法結(jié)果是否一致。
　　 結(jié)果:
　　 1.siRNA抑制ZNF139前后胃癌細(xì)胞ZNF139mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn):陽(yáng)性組的ZNF139mRNA的

5、相對(duì)表達(dá)量(15.6±1.61)×10-5顯著低于空白對(duì)照組（68.8×±4.05）×10-5，且二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=9.1×10-10＜0.05);空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組ZNF139mRNA的相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.491＞0.05)。
　　 2.胃癌細(xì)胞雙向差異凝膠電泳圖譜中差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的分析:應(yīng)用DeCyderDifferentialAnalysisSoftware選取了8個(gè)具有顯著表達(dá)差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)

6、，并用Ettanspotpicker系統(tǒng)進(jìn)行挖點(diǎn)。這些蛋白質(zhì)在陽(yáng)性組胃癌細(xì)胞蛋白樣品中表達(dá)上調(diào)的有5個(gè)，表達(dá)下調(diào)的有3個(gè)。
　　 3.對(duì)差異蛋白的質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn):在上述8個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)中有7個(gè)被鑒定為有意義的蛋白質(zhì)分別為:開(kāi)關(guān)相關(guān)蛋白70、遠(yuǎn)上游元件結(jié)合蛋白1、熱休克蛋白60、膜聯(lián)蛋白A7、小泛素樣調(diào)節(jié)蛋白1、含伴侶蛋白的少尾復(fù)合體蛋白1和膜聯(lián)蛋白A2;另外1個(gè)未能鑒定出有意義的蛋白質(zhì)。對(duì)比胃癌細(xì)胞蛋白圖譜發(fā)現(xiàn):開(kāi)關(guān)相

7、關(guān)蛋白70、遠(yuǎn)上游元件結(jié)合蛋白1、熱休克蛋白60、小泛素樣調(diào)節(jié)蛋白1在陽(yáng)性組胃癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而膜聯(lián)蛋白A7、含伴侶蛋白的少尾復(fù)合體蛋白1、膜聯(lián)蛋白A2則在陽(yáng)性組胃癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。
　　 4.應(yīng)用Westernblot法驗(yàn)證差異蛋白的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn):遠(yuǎn)上游結(jié)合蛋白1在陽(yáng)性組胃癌細(xì)胞中均表達(dá)上調(diào)，膜聯(lián)蛋白A7和膜聯(lián)蛋白A2在陽(yáng)性組胃癌細(xì)胞中均表達(dá)下調(diào)，陽(yáng)性組與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)方法所得結(jié)

8、果吻合。
　　 結(jié)論:
　　 1.ZNF139mRNA的表達(dá)在陽(yáng)性組BGC823細(xì)胞中表達(dá)明顯降低，說(shuō)明siRNA抑制了ZNF139基因的轉(zhuǎn)錄。
　　 2.從siRNA抑制ZNF139前后的胃癌細(xì)胞總蛋白中分離出8個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)且其中7個(gè)被鑒定為有意義的蛋白，說(shuō)明ZNF139基因的表達(dá)被抑制后胃癌細(xì)胞蛋白表達(dá)具有差異性。
　　 3.siRNA抑制ZNF139胃癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)中:開(kāi)關(guān)相關(guān)蛋白70、遠(yuǎn)上游元件

9、結(jié)合蛋白1、熱休克蛋白60、小泛素樣調(diào)節(jié)蛋白1表達(dá)上調(diào)，而膜聯(lián)蛋白A7、含伴侶蛋白的少尾復(fù)合體蛋白1膜聯(lián)蛋白A2表達(dá)下調(diào)，提示這些蛋白的表達(dá)與ZNF139基因的表達(dá)相關(guān);上述蛋白與胃癌的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等有關(guān)，進(jìn)而說(shuō)明ZNF139可能直接或間接與胃癌細(xì)胞的上述生物學(xué)行為有關(guān)。
　　 4.通過(guò)蛋白印跡法檢驗(yàn)鑒定出的蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)染前后胃癌細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均與蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定結(jié)果相符合。這說(shuō)明本研究鑒定出的蛋白質(zhì)與ZNF139