基于鐵蛋白的納米結(jié)構(gòu)可控自組裝與功能化.pdf

1、背景：自組裝納米結(jié)構(gòu)可以介導(dǎo)酶分子數(shù)量的增加和抗體的有效固定，用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中提高檢測(cè)靈敏度。分子自組裝是指分子在沒有人為干預(yù)的情況下，自發(fā)形成結(jié)構(gòu)高度有序的分子組裝體的過程，其廣泛存在于自然界中，是生命體最主要的組織形式。近年來，分子自組裝這一策略被納米技術(shù)科學(xué)家所借鑒，已成為納米材料制備的重要策略。但是，分子自組裝是一個(gè)自發(fā)的熱力學(xué)過程，其發(fā)生過程難以控制；與此同時(shí)，自組裝元件的結(jié)構(gòu)相對(duì)單一，不同的自組裝元件間難以發(fā)生相互作用

2、，這導(dǎo)致自組裝的尺寸控制與多功能化困難，限制了檢測(cè)靈敏度的提高。因此，開發(fā)可控的、多功能化的自組裝策略是納米器件設(shè)計(jì)和制備所面臨的關(guān)鍵技術(shù)挑戰(zhàn)。
　　目的：探索自組裝操控技術(shù)，發(fā)展自組裝納米結(jié)構(gòu)的多功能化策略，建立自組裝多功能化納米器件的可控制備方法，制備具有信號(hào)擴(kuò)增能力的蛋白納米器件。
　　方法：本研究以重組的人重鏈鐵蛋白（recombinantheavychainofhumanferritin，rHF）籠型納米結(jié)構(gòu)為材料

3、，利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)和胞內(nèi)蛋白質(zhì)修飾系統(tǒng)，從體外與胞內(nèi)兩個(gè)途徑對(duì)蛋白納米材料的可控自組裝進(jìn)行探索，并開展可控多功能化和非對(duì)稱功能化的研究。首先，我們?cè)隗w外建立了一種尺寸可調(diào)的可控自組裝策略，該策略通過控制自組裝元件表面的相互作用位點(diǎn)數(shù)量，進(jìn)而控制發(fā)生相互作用的自組裝元件數(shù)量，最終實(shí)現(xiàn)自組裝納米結(jié)構(gòu)的尺寸可控?；诖嗽?，我們利用自生物素化鐵蛋白（autobiotinylatedferritinnanoparticles，bFNP）和辣根

4、過氧化物酶修飾的鏈霉親和素（streptavidin-labeledhorseradishperoxidase，SA-HRP）作為組裝元件，以生物素-親和素這一特異性相互作用為驅(qū)動(dòng)力，構(gòu)建了尺寸可調(diào)的酶納米復(fù)合物（enzymenanocomposite，ENC）。所獲得的酶納米復(fù)合物具有親和素的表面，同時(shí)整合大量的酶分子，可用于免疫檢測(cè)中，大幅提高了常規(guī)免疫檢測(cè)的靈敏度。其次，我們初步探索了鐵蛋白納米顆粒的胞內(nèi)可控非對(duì)稱自組裝的策略，通

5、過學(xué)習(xí)和借鑒合成生物學(xué)的研究方法，利用細(xì)菌的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，建立細(xì)菌內(nèi)蛋白差量表達(dá)體系，使具有不同功能配體的鐵蛋白自組裝元件在大腸桿菌胞內(nèi)差量表達(dá)和非對(duì)稱自組裝，最終實(shí)現(xiàn)表面具有不同功能配體數(shù)量的非對(duì)稱納米顆粒的胞內(nèi)一步可控制備。
　　結(jié)果：在尺寸可調(diào)酶納米復(fù)合物的研究中，可控的自組裝可以通過調(diào)節(jié)兩個(gè)構(gòu)建元件的化學(xué)計(jì)量比來實(shí)現(xiàn)。組裝過程中，化學(xué)計(jì)量比的可控通過運(yùn)用不同量的SA-HRP滴定等量的bFNPs而實(shí)現(xiàn)。通過對(duì)不同比例構(gòu)建的酶

6、納米復(fù)合物進(jìn)行表征，我們發(fā)現(xiàn)在飽和或過量的SA-HRP滴定中，形成核心只含有一個(gè)鐵蛋白顆粒的單體酶納米復(fù)合物；當(dāng)逐漸降低SA-HRP的滴定量，bFNPs將彼此共享SA-HRP，導(dǎo)致bFNPs的聚集和同時(shí)ENC尺寸的增加。在胞內(nèi)可控自組裝中，成功構(gòu)建了共表達(dá)載體，驗(yàn)證了不同功能化的蛋白亞基在胞內(nèi)自組裝時(shí)可以同時(shí)組裝在一個(gè)蛋白籠上，得到了非對(duì)稱多功能化的鐵蛋白納米顆粒。
　　結(jié)論：①我們可以通過控制自組裝元件表面的相互作用位點(diǎn)數(shù)量，進(jìn)