家蠶細(xì)胞凋亡抑制因子BmAPI5基因克隆與功能研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡在生物體的生命活動(dòng)中扮演著重要角色，其過(guò)程受到眾多基因調(diào)控。其中，API5（Apoptosis inhibitor-5）是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡抑制因子，能有效阻斷細(xì)胞凋亡進(jìn)程，但其結(jié)構(gòu)與已知的細(xì)胞凋亡抑制蛋白（IAPs）并不相同。目前有關(guān)API5的研究主要集中在人類(lèi)癌癥相關(guān)等方面，因其高水平表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生而倍受關(guān)注。通過(guò)基因序列的比對(duì)分析，在家蠶（Bombyx mori）基因組中發(fā)現(xiàn)存在該蛋白的同源基因BmAPI5（Gen

2、Bank編號(hào):XM004927989），但其在家蠶體內(nèi)的功能與作用至今尚未見(jiàn)有報(bào)道。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴克隆獲得家蠶BmAPI5基因全長(zhǎng)cDNA序列，其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1，671 bp，編碼557個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量63.13 kD，等電點(diǎn)6.09。BmAPI5蛋白主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，具有LxxLL基序和亮氨酸拉鏈等特征結(jié)構(gòu)域。家蠶BmAPI5與黑腹果蠅和人類(lèi)同源基因Aac11的氨基酸序列相似性分別為46％和4

3、7％。將家蠶BmAPI5開(kāi)放閱讀框序列克隆至原核表達(dá)載體pET-32a中，經(jīng)大腸桿菌（Escherichia coli）誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組BmAPI5蛋白，并制備其兔多克隆抗體。⑵分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和Western雜交技術(shù)分析家蠶BmAPI5基因在不同發(fā)育時(shí)期、不同組織以及微生物感染后的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平。BmAPI5基因在家蠶卵、幼蟲(chóng)和蛹中均有不同程度的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，其中以5齡幼蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄水平顯著為高。在不同組織中，BmAPI5以脂

4、肪體中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平顯著較高。家蠶核型多角體病毒(Bombyx morinucleopolyhedrovirus，BmNPV)和大腸桿菌侵染均能快速顯著誘導(dǎo)BmAPI5基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，其中以BmNPV的誘導(dǎo)作用較為明顯。這表明BmAPI5可能參與BmNPV-宿主的互作機(jī)制。⑶在家蠶BmN細(xì)胞中分別構(gòu)建BmAPI5過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)體系的基礎(chǔ)上，分別采用流式細(xì)胞技術(shù)和Caspase活性檢測(cè)技術(shù)分析BmAP I5表達(dá)變化對(duì)家蠶細(xì)胞凋亡的影