家蠶30K蛋白的結(jié)構(gòu)功能及五齡血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、家蠶不僅是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，同時(shí)也是研究昆蟲(chóng)生理和生化的重要模式生物。家蠶具有開(kāi)放的血漿循環(huán)系統(tǒng)，特別是在五齡幼蟲(chóng)的變態(tài)發(fā)育時(shí)期，各種蛋白質(zhì)由脂肪體合成并分泌到血漿中執(zhí)行相應(yīng)的功能，這些蛋白質(zhì)對(duì)研究家蠶生理生化的機(jī)制非常重要。
　　 然而，對(duì)這些蛋白質(zhì)的研究尚不透徹，如家蠶血漿中存在著一類分子量在30kDa左右的脂蛋白，被稱為家蠶30K蛋白家族。它們無(wú)論是核苷酸序列還是蛋白質(zhì)序列都很相似、同源性高，它們從脂肪體合成，之后分泌到

2、血漿中，而且只從五齡幼蟲(chóng)變態(tài)發(fā)育時(shí)期開(kāi)始特異表達(dá)。推測(cè)它們的功能可能涉及到脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)、胚胎發(fā)育、細(xì)胞程序化死亡及血漿天然免疫反應(yīng)等等，但是有關(guān)家蠶30K蛋白的具體功能仍不清楚。
　　 我們對(duì)家蠶血漿30K蛋白進(jìn)行天然分離并提純、結(jié)晶，借助硒代甲硫氨酸和native重組蛋白的表達(dá)、純化結(jié)晶，使用多波長(zhǎng)反常散射法確定了30K蛋白Bmlp7的相位并解析了結(jié)構(gòu)，其分辨率為1.91 ?。Bmlp7表現(xiàn)為典型的α+β結(jié)構(gòu)，由兩個(gè)完全分離的

3、結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：all-α的N端結(jié)構(gòu)域（NTD）和all-β的C端結(jié)構(gòu)域（CTD）。其中，CTD屬于β-三葉草超家族結(jié)構(gòu)域。與已知結(jié)構(gòu)的14個(gè)β-三葉草家族成員相比較,30K蛋白家族為一個(gè)新的三葉草家族。推測(cè)Bmlp7的NTD可能具有結(jié)合脂的能力，而CTD存在結(jié)合糖的潛在位點(diǎn)，因而可能間接地參與昆蟲(chóng)天然免疫反應(yīng)。然而，我們的實(shí)驗(yàn)未能檢測(cè)到它與糖或者脂分子結(jié)合，可能該蛋白的天然底物不是我們?cè)囼?yàn)中用的的糖或者脂分子，對(duì)這一蛋白的功能研究還需要進(jìn)

4、一步的深入研究。
　　 五齡血漿蛋白質(zhì)中除了30K蛋白家族以外，還有很多功能和性質(zhì)都未知的蛋白質(zhì)。我們除了可以在基因組水平上研究家蠶基因的種類和功能之外，更可以從整體的角度分析家蠶血漿內(nèi)蛋白質(zhì)，同時(shí)從個(gè)體的角度對(duì)重要功能的蛋白質(zhì)一一進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的研究，從而揭示該蛋白質(zhì)在家蠶生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期中的重要作用。我們利用兩種方法并行研究了家蠶在五齡幼蟲(chóng)階段所表達(dá)的血漿蛋白質(zhì)組。以一維SDS-PAGE和不同pH值的血漿溶液為基礎(chǔ)分別進(jìn)行膠內(nèi)和

5、溶液酶解，并結(jié)合多維液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）進(jìn)行結(jié)果分析。鑒定出的289個(gè)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分布從4-12，大多分子量分布在10-60kDa，它們的可溶性都很高。這些蛋白質(zhì)通過(guò)NCBI比對(duì)和GO分類成12類，大多數(shù)蛋白質(zhì)都與儲(chǔ)存、防御、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等相關(guān)，這與這個(gè)時(shí)期的生理生化變化是密不可分的。我們對(duì)其中一些高豐度蛋白質(zhì)進(jìn)行了進(jìn)一步的分析，如30K蛋白從五齡初期出現(xiàn)到蟻蠶時(shí)期消失，可能與它們的功能密切相關(guān)。對(duì)血漿蛋白質(zhì)組的研究