缺血再灌注大鼠腎組織及尿DcR2的變化與腎損害慢性化的關(guān)系.pdf

1、目的：
　　急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是臨床上常見的危重疾病。DcR2作為腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL)的受體之一，具有凋亡抵抗作用。同時，DcR2也可作為細胞衰老的標(biāo)志，在腫瘤細胞和衰老的成纖維細胞以及體外高糖培養(yǎng)的HK-2細胞中高表達。研究發(fā)現(xiàn)，通過干預(yù)DcR2表達，肝

2、臟纖維化程度減輕，提示DcR2可能在纖維化進展過程中發(fā)揮重要作用。另外，DcR2作為跨膜受體，其胞外段可被蛋白酶剪切形成具有生物功能活性的可溶性分子，因此DcR2可在血清中檢測到。然而，截至目前DcR2在缺血再灌注大鼠腎組織和尿液中的表達水平以及與腎組織慢性化之間的關(guān)系尚無研究報道。
　　本實驗主要包括以下三方面，首先為缺血再灌注大鼠腎組織DcR2表達及uDcR2/Cr水平與腎功能及腎組織慢性評分的相關(guān)性分析;其次，缺血再灌注大鼠

3、腎組織中DcR2與腎間質(zhì)纖維化標(biāo)志物α-SMA、CollagenⅣ的關(guān)系;最后，缺血再灌注大鼠腎組織中DcR2與衰老標(biāo)志物SA-β-gal、P16Ink4a的關(guān)系。
　　方法：
　　1.構(gòu)建輕、重度I/R大鼠腎損傷模型
　　隨機選取健康雄性SD大鼠，用無損動脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂制備大鼠缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷模型。輕度損傷(I/R45min)和重度損傷（I/R60min）模型分別夾

4、閉45min、60min后放開雙側(cè)動脈夾給予腎臟再灌注。假手術(shù)(sham)模型，僅分離雙側(cè)腎蒂但不用動脈夾夾閉，其它操作步驟與I/R組相同。
　　2.檢測兩組I/R大鼠腎功能
　　制備I/R大鼠腎損傷模型后，分別于術(shù)后1、3、7、21、35天收集雙側(cè)腎組織，腹主動脈穿刺采集血液2ml，代謝籠收集24小時尿液。檢測各組血肌酐(Serum creatinine，Scr)、尿NAG酶水平。
　　3.兩組I/R大鼠腎組織慢性化

5、評分
　　隨機選取腎組織皮髓交界區(qū)域10個不連續(xù)的視野，計算炎細胞浸潤、腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化面積的比例：0分，無損傷;1分，＜25％;2分，25％～50％;3分，51％～75％;4分＞75。
　　4.免疫組化檢測兩組I/R大鼠腎組織DcR2表達
　　選取待檢測的大鼠腎組織蠟塊，石蠟切片（厚度2μm），常規(guī)脫蠟、水化后行免疫組化檢測腎組織DcR2表達。在高倍顯微鏡，200倍視野下計數(shù)，每個腎組織隨機選取10個不連續(xù)的

6、視野。鏡下觀察細胞質(zhì)被染成棕色即為DcR2陽性。計算DcR2陽性區(qū)域面積占總面積的比例，0分：0％～5％;1分：6％～25％;2分：26％～50％;3分：51％～75％;4分：≥76％[10]。
　　5.ELISA檢測兩組I/R大鼠uDcR2/Cr水平
　　制備I/R大鼠腎損傷模型，分別于術(shù)后1、3、7、21、35天使用代謝籠收集24小時尿液，3000rpm/分鐘離心20-30分鐘，吸取上層血清。酶聯(lián)免疫吸附法(ELI SA

7、)檢測尿DcR2(uDcR2)水平并使用尿肌酐校正，結(jié)果以uDcR2/Cr表示。
　　6.兩組I/R大鼠腎組織DcR2表達量及uDcR2/Cr水平與腎功能及腎組織慢性化評分的相關(guān)性分析
　　腎組織DcR2的表達及uDcR2水平與腎功能及腎組織慢性化評分的相關(guān)性使用spearman統(tǒng)計學(xué)分析方法。
　　7.免疫熒光共染檢測I/R60min大鼠腎組織DcR2與纖維化標(biāo)志的表達關(guān)系
　　(1)免疫熒光共染檢測缺血再灌注

8、7天后兩組I/R大鼠模型腎組織DcR2與纖維化指標(biāo)α-SMA和CollagenⅣ的共表達。激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果并進行腎間質(zhì)纖維化程度評分。使用高倍顯微鏡，在200倍視野下，隨機選取10個不連續(xù)的區(qū)域進行計數(shù)，采用雙盲法，由兩名醫(yī)師共同實施。計算α-SMA和CollagenⅣ陽性區(qū)域面積：0分，無;1分，＜25％;2分，25％～50％;3分，51％～75％;4分，＞75％[10]。
　　(2)使用spearman分析I/R大鼠

9、腎組織DcR2表達量與腎間質(zhì)纖維化程度的關(guān)系。
　　8.免疫化學(xué)染色檢測I/R60min大鼠腎組織DcR2與衰老標(biāo)志的表達關(guān)系
　　(1)免疫組化和SA-β-Gal染色檢測腎組織DcR2與SA-β-Gal的共表達情況。高倍顯微鏡下觀察結(jié)果并計數(shù)呈DcR2和SA-β-Gal雙陽性表達的腎小管的比例。
　　(2)免疫熒光共染檢測腎組織DcR2和P16Ink4a共表達情況。激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果并計數(shù)呈DcR2和P16I

10、nk4a雙陽性表達的腎小管上皮細胞比例。
　　結(jié)果:
　　1.兩組I/R大鼠腎功能變化
　　I/R45min及I/R60min大鼠Scr、uNAG/Cr水平顯著高于Sham組。I/R45min大鼠再灌注1天后Scr水平到達峰值后逐漸下降，35天時Scr水平已降至正常(P＞0.05)。I/R60min大鼠各時間點Scr水平均顯著高于I/R45min，再灌注3天Scr水平到達峰值后逐漸下降，但35天時仍有80％的大鼠Scr

11、未恢復(fù)正常。uNAG/Cr變化與Scr基本相同，I/R45min大鼠uNAG/Cr再灌注1天后逐漸恢復(fù)正常，而I/R60min大鼠再灌注35天uNAG/Cr仍高于正常水平(P＜0.05)。
　　2.兩組I/R大鼠腎組織慢性化評分
　　缺血再灌注后皮髓交界區(qū)域出現(xiàn)廣泛的腎小管壞死、脫落等急性病理損傷表現(xiàn)。與Sham組（0分）相比，再灌注35天I/R45min大鼠腎組織基本恢復(fù)正常，腎組織慢性化評分為(3.67±0.58)分。I

12、/R60min與I/R45min相比，病理損傷程度明顯加重，并在35天可觀察到30％以上區(qū)域出現(xiàn)腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化等慢性化表現(xiàn)，腎組織慢性化評分為(8.33±1.29)分。
　　3.兩組I/R大鼠腎組織DcR2表達與分布
　　DcR2僅在腎小管上皮細胞表達，正常腎組織DcR2低表達。I/R45min大鼠再灌注1天腎組織DcR2表達量到達峰值，隨后逐漸下降，再灌注35天DcR2表達量與Sham組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞

13、0.05)。I/R60min大鼠DcR2表達量明顯高于I/R45min，再灌注3天到達峰值后逐漸下降，但35天時仍有大量DcR2表達，與Sham組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。DcR2高表達主要見于修復(fù)不良的區(qū)域，而DcR2低表達部位腎組織修復(fù)良好。
　　4.兩組I/R大鼠uDcR2/Cr水平
　　Sham組uDcR2水平低下，缺血再灌注后uDcR2水平顯著升高。I/R45min組大鼠再灌注后第1天uDcR2水平明

14、顯升高并到達峰值，后隨再灌注時間延長uDcR2/Cr水平逐漸降低，再灌注第35天時uDcR2/Cr水平降至正常(P＞0.05)。I/R60min大鼠再灌注第3天uDcR2水平到達峰值，隨著再灌注時間延長uDcR2水平逐漸降低但仍明顯高于Sham組(P＜0.05)。
　　5.兩組I/R大鼠腎組織及尿液DcR2變化與腎功能及組織慢性化評分的相關(guān)性分析
　　I/R45min、I/R60min大鼠腎組織DcR2表達量與Scr、uNA

15、G/Cr及腎組織慢性化評分呈正相關(guān)，I/R45min相關(guān)系數(shù)分別為0.943、0.913、0.829(P＜0.05);I/R60min相關(guān)系數(shù)分別為0.857、0.909、0.851(P＜0.05)。
　　I/R45min、I/R60min大鼠uDcR2/Cr水平與Scr、uNAG/Cr及腎組織慢性化評分呈正相關(guān)，I/R45min相關(guān)系數(shù)分別為0.943、0.943、0.886(P＜0.05);I/R60min相關(guān)系數(shù)分別為0.9

16、20、0.847、0.827(P＜0.05)。
　　6.I/R60min大鼠腎組織DcR2與腎小管間質(zhì)纖維化標(biāo)志的關(guān)系
　　I/R60min大鼠再灌注21、35天可見DcR2陽性腎小管及陽性區(qū)域高表達α-SMA和CollagenⅣ，DcR2與腎小管間質(zhì)纖維化標(biāo)志α-SMA和CollagenⅣ的表達成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.885、0.806(P＜0.05)。提示DcR2與缺血再灌注后腎組織慢性化有關(guān)。
　　7.I/R

17、60min大鼠腎組織DcR2與衰老標(biāo)志的關(guān)系
　　免疫化學(xué)染色結(jié)果示，I/R60min組大鼠腎組織SA-β-gal、P16Ink4a隨著再灌注時間延長表達增加，并且85％以上的DcR2陽性腎小管高表達SA-β-gal、P16Ink4a。提示DcR2陽性的腎小管上皮細胞具有衰老表型。
　　結(jié)論：
　　本研究證實了輕、重度缺血在灌注損傷模型中腎組織DcR2的表達與腎組織慢性化以及與腎小管細胞衰老密切相關(guān)，表明了DcR2可能