超聲造影監(jiān)測兔腎缺血再灌注損傷及其與腎組織ICAM-1表達(dá)關(guān)系的實驗研究.pdf

1、目的:應(yīng)用超聲造影(Contrast-enhanced Ultrasound,CEUS)及其量化技術(shù)定量評估兔腎缺血再灌注損傷,并比較腎皮質(zhì)時間-強(qiáng)度曲線(timeintensity curve,TIC)各參數(shù)與其腎組織ICAM-1(Intercellular-AdhesionMolecule-1,ICAM-1)表達(dá)量的相關(guān)性,探討了超聲造影在腎缺血再灌注損傷中的診斷價值。
　　 方法:24只健康新西蘭家兔隨機(jī)分組,按照時間點的

2、不同,分為對照組(I0)、缺血再灌注組,其中按再灌注時間的不同分為再灌注24h組(I24h)、再灌注3d組(I3d)、再灌注5d組(I5d)共4組,每組6只。術(shù)前剪去兔腎區(qū)兔毛,用二維狄階超聲觀察兔腎位置并作標(biāo)記,隨后于兔腿肌肉最豐富處肌肉注射速眠新Ⅱ進(jìn)行個身麻醉,用酒精棉球作雙腎區(qū)局部皮膚消毒后進(jìn)行無菌操作。對照組只切除右腎,左腎不予處理,關(guān)腹。行超聲檢查。I24h、I3d、I5d3個組的18只兔行右腎切除術(shù)后,分離左腎,用無創(chuàng)動脈夾

3、夾閉左腎腎蒂血管造成缺血,觀察到腎臟由鮮紅色迅速變暗紅,表明缺血成功,開始計算缺血時間。一小時后松開動脈央,觀察腎臟由暗紅變鮮紅,表示再灌注成功,即刻開始計算缺血再灌注時間。關(guān)腹,室溫清潔飼養(yǎng)。分別于24h、3d、5d不同時間點行包括二維、彩色多普勒(color Doppler flow imaging,CDFI)、能量多普勒(power Doppler imaging,PDI)及超聲造影(CEUS)在內(nèi)的超聲檢查。比較不同檢查狀態(tài)下的

4、腎血液灌注。分析諧波狀態(tài)下超聲造影模式及定量分析軟件(Wash in／Wash out)所得腎皮質(zhì)不同部位回聲的時間-強(qiáng)度曲線(TIC)。參數(shù)包括開始增強(qiáng)時間(arrival time,AT),灌注峰值時間(time to peak,TIP),灌注峰值強(qiáng)度變化(difference between Band the intensitv at t=0,A),曲線下面積(Area under the curve,Area),曲線上升支斜率(

5、gradient between start frame to peak frame,Grad)。每組超聲造影檢測完畢后即刻處死大白兔,低溫下取部分腎皮質(zhì)組織行病理切片檢查。取部分于-60℃冷藏,基于雙抗體夾心技術(shù),嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫檢測試劑盒測得各組兔腎皮質(zhì)組織細(xì)胞粘附分子-1表達(dá)含量,并分析其與超聲造影TIC曲線血參數(shù)的相關(guān)性。組間、組內(nèi)參數(shù)的比較采用單因素方差齊性分析檢驗,不同組別間TIC曲線各參數(shù)與對應(yīng)腎組織ICAM－1表達(dá)含量關(guān)

6、系采用直線相關(guān)分析,計算其相關(guān)系數(shù)r值,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:實驗中所有兔子麻醉顯效良好,造模順利,造影時均在完全清醒狀態(tài)下進(jìn)行。(1)常規(guī)二維超聲檢查顯示兔腎形態(tài)規(guī)則,距體表深約1.3-1.8cm,大小約(2.85±1.03)x(2.23±0.67)cm2,包膜完整,實質(zhì)回聲均勻,CDFI和PDI均能顯示兔腎呈“樹枝狀”分布的血管分支。且脈沖多普勒(Pulsed wave Doppler,PW)能檢測

7、出兔腎動脈血流動力學(xué)改變,但CDFI不能清晰顯示弓形動脈以其以下動脈的血流灌注,PDI雖能顯示包膜下血流灌注,但是無量化刻度指標(biāo)。(2)諧波狀態(tài)下超聲造影結(jié)果:①對照組:經(jīng)耳緣靜脈快速團(tuán)注造影劑SonoVue3—8s后,造影劑快速從腎竇達(dá)腎包膜下,按腎段動脈、葉間動脈、弓形動脈、腎皮質(zhì)、腎髓質(zhì)、腎竇依次強(qiáng)化,至整個左腎形成“火球樣”增強(qiáng)后,約35-50s開始消退,消退次序同前,但是腎皮質(zhì)消退最遲。②缺血再灌注組:增強(qiáng)模式同前,肉眼觀察開

8、始增強(qiáng)時間及消退時間均延長,但是差別不大。(3)TIC曲線參數(shù)分析①I0組:腎皮質(zhì)TIC曲線表現(xiàn)為急速上升達(dá)峰值后快速下降,參數(shù)分別如下:A(15.027±13.488dB)、AT(8.628±1.546s)、TTP(4.671±0.853s)、Area(630.573±137.793dBs)、Grad(4.176±0.2911 dB／s);②I24h組:TIC曲線表現(xiàn)為上升速度緩慢,下降速度緩慢,參數(shù)如下:A(16.626±15.27

9、1dB)、AT(12.806±4.011s)、TTP(18.187±4.172s)、Area(971.799±206.877dBs)、Grad(1.498±1.460 dB／s):③I3d組:TIC曲線表現(xiàn)為上升速度較慢,下降速度更慢,參數(shù)如下:A(15.846±16.233dB)、AT(13.492±4.978s)、TTP(23.692±7.232s)、Area(939.190±393.443dBs)、Grad(1.196±0.977

10、 dB／s)；④I5d組:TIC曲線表現(xiàn)為上升速度較I24h組和I3d組快,但不及I0組,下降速度也相同。參數(shù)如下:A(18.655±15.835dB)、AT(10.567±3.849s)、TTP(13.313±3.913s)、Area(964.248±300.197dBs)、Grad(2.014±0.474 dB／s)。組間比較發(fā)現(xiàn):①TTP和AT值組間比較變化趨勢一致:再灌注組均比正常對照組延長,而再灌注24h到再灌注3d時呈增高趨

11、勢,并在第三天時達(dá)高峰,再灌注第3d到再灌注第5d呈縮短趨勢,但是再灌注5d時仍比正常對照組時間長,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。②Grad值各組間比較,差別非常顯著(P<0.01):缺血再灌注組與對照組比較斜率均明顯降低,而且再灌注組間差別也非常顯著。缺血再灌注3d時曲線Grad值最低,上升緩慢,再灌注5d時回升,表現(xiàn)上升加速,但仍慢于正常對照組；③Area值缺血再灌注組較對照組明顯升高(P<0.01),但是缺血再灌注組間無明顯差

12、異(P>0.05)。④A值各組間比較無明顯變化(P>0.05),無統(tǒng)計學(xué)意義。(4)病理檢查結(jié)果:正常對照組腎單位顯示清晰,腎小管、腎小球排列整齊；再灌注24小時組,兔腎腎小管上皮細(xì)胞體積增大,至空泡形成,以氣球樣變性為主。間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞明顯增加,炎癥浸潤明顯；再灌注3d組,兔腎腎小管管腔擴(kuò)張,部分上皮細(xì)胞出現(xiàn)核濃縮、核破碎及核溶解現(xiàn)象,呈凝固性壞死,同時壞死區(qū)周邊出現(xiàn)充血和炎癥反應(yīng)帶,間質(zhì)水腫明顯,可見大量淋巴細(xì)胞浸潤；再灌注5d組,

13、腎小管管腔擴(kuò)張,管腔內(nèi)可見少些細(xì)胞管型,儀少數(shù)上皮細(xì)胞見變性及壞死,新生毛細(xì)血管數(shù)量增多,間質(zhì)水腫,可見淋巴細(xì)胞。(5)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出了標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸方程,再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。腎皮質(zhì)ICAM－1表達(dá)含量結(jié)果如下:I0組(29.272±5.257ng／ml),I24h組(58.770±6.599ng／ml),I3d組(80.120±10.539ng／ml),I5d組(50.676±6.3

14、19ng／ml)。缺血再灌注組含量較對照組均明顯升高,P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。缺血再灌注組間比較,I3d組最高,I5d組下降,雖低于I24h組但仍高于對照組,且組間比較差別顯著(P<0.01),有統(tǒng)計學(xué)意義。(6)各組TIC曲線參數(shù)分別和腎皮質(zhì)ICAM-1表達(dá)含量的直線相關(guān)分析:Grad與腎皮質(zhì)ICAM-1表達(dá)含量呈負(fù)相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r=-0.923,P<0.01),AT、TTP與腎皮質(zhì)ICAM-1表達(dá)含量呈正相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r

15、分別為r=0.697,r=0.892,P<0.01),A、Area,值與ICAM-1表達(dá)含量無相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)分別為r=0.108,r=0.295,P>0.05)。
　　 結(jié)論:(1)超聲造影技術(shù)較常規(guī)超聲檢查更敏感反映兔腎缺血再灌注損傷前后腎皮質(zhì)微小動脈的血流灌注狀態(tài)；(2)TIC曲線可以動態(tài)反映血液中造影劑濃度隨時間的變化,獲得的定量參數(shù)為微泡的充填速度和平衡后的微泡聲強(qiáng)度,即準(zhǔn)確反映紅細(xì)胞在微血管的流動速度和組織的血流容積

16、；(3)兔腎缺血再灌注損傷發(fā)生后的三天內(nèi)有大量的中性粒細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞及組織間隙,產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),同時產(chǎn)生大量的壞死物質(zhì)阻寒血管管腔,腎組織受到最嚴(yán)重的損傷。渡過該“危險期”,腎功能可以部分或是完全恢復(fù)。進(jìn)一步闡述了中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的缺血再灌注損傷的機(jī)制。(4)TIC曲線的各個參數(shù)和腎組織ICAM-1表達(dá)含量間存在的相關(guān)性表明超聲造影檢測技術(shù)不僅定量評價了腎臟血流灌注狀態(tài),而且還無創(chuàng)反映了腎組織炎癥反應(yīng)程度和范圍；(5)超聲造影