馬索羅酚對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠血腦屏障的影響及機制研究.pdf

1、目的:應(yīng)用多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis，MS)國際上公認的動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental AutoimmuneEncephalomyelitis，EAE)小鼠，研究馬索羅酚(nordihydroguaiaretic acid，NDGA)對EAE小鼠血腦屏障(blood brain barrier，BBB)的影響及相關(guān)機制，旨在觀察NDGA對EAE小鼠的治療作用并探究該藥物對于EAE小鼠BB

2、B潛在的保護作用及其可能的機制，從而為今后臨床應(yīng)用馬索羅酚輔助治療MS等中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病提供新的理論依據(jù)，尋找臨床治療MS的新靶點。
　　方法:將66只8-10周雌性近交系C57BL/6小鼠(體重為18-20g)，隨機分為三組:正常對照組、EAE組、馬索羅酚組，其中每組各為22只。各組又分為發(fā)病前給藥組與發(fā)病后給藥組兩個亞組。其中發(fā)病前給藥組又分為免疫后第8天組、免疫后第14天組兩個亞組，各亞組2只。發(fā)病后給藥組分為給藥

3、第10天組、給藥第20天組兩個亞組，其中給藥后第10天組6只，給藥后第20天組12只。免疫小鼠時應(yīng)用生理鹽水將抗原MOG35-55稀釋成為5mg/ml后，將完全弗氏佐劑（結(jié)核桿菌的終濃度為4mg/ml）按同等體積加入，混合均勻，充分乳化，將小鼠用乙醚麻醉后，固定小鼠，在小鼠脊柱兩側(cè)分四點進行皮下注射，每個點注射0.025ml，總共0.1ml。于免疫當(dāng)天的第0h及第48h分兩次給每只小鼠腹腔注射500ng PTX（1000ng/只）。空白

4、對照組不予免疫。將免疫當(dāng)天記為第0天，發(fā)病前給藥組自免疫第0天開始給予藥物干預(yù)，給予NDGA組每只小鼠NDGA10mg/kg每日腹腔注射;給予EAE組及正常對照組小鼠5％ DMSO10 ml/kg每日腹腔注射。發(fā)病后給藥組待每組動物發(fā)病達1分（15分法）后開始給予NDGA組的每只小鼠NDGA10mg/kg每日腹腔注射;給予EAE組及正常對照組的小鼠5％ DMSO10 ml/kg每日腹腔注射。于動物免疫當(dāng)日及免疫后每日上午8:00與下午1

5、7:00對動物體重、活動狀況、精神狀態(tài)以及皮毛光澤度進行觀察，并采用國際通用的15分法評分標(biāo)準(zhǔn)分別對各組動物進行神經(jīng)功能評分。各組小鼠于不同時間點取材后應(yīng)用熒光顯微鏡法觀察伊文斯蘭染色后血腦屏障通透性的改變，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測小鼠脊髓組織中claudin-5、ZO-1、occludin、MMP-9的表達情況，應(yīng)用confocal法檢測小鼠腦組織中緊密連接蛋白claudin-5、ZO-1、occludin的表達與定位情況。應(yīng)用實時熒光

6、定量PCR(RT-PCR)法檢測小鼠脊髓組織中MMP-9、NF-κ BmRNA水平的改變情況。
　　結(jié)果:
　　1神經(jīng)功能評分
　　正常對照組小鼠均未發(fā)病。分別比較給藥第10天與給藥第20天EAE組與NDGA組中小鼠的神經(jīng)功能評分均數(shù)。在不同時間點NDGA組小鼠的神經(jīng)功能評分低于EAE組小鼠的神經(jīng)功能評分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2伊文斯蘭染色結(jié)果
　　發(fā)病前給藥組:給藥第8天EAE組及ND

7、GA組脊髓組織中可見少許的紅色熒光分布于脊膜下，給藥第14天EAE組可見大量的紅色熒光分布于脊膜下，NDGA組的紅色熒光與EAE組相比較分布于脊膜下的較少。而對照組小鼠脊膜下未見明顯的熒光分布。
　　發(fā)病后給藥組:給藥10天組中EAE組小鼠脊髓組織中脊膜下的熒光成斑片狀分布，且熒光強度高，NDGA組與EAE組相比較，熒光范圍較小且強度較弱。給藥后第20天，NDGA組與EAE組伊文斯蘭無論從滲出的量還是從熒光強度上與給藥后第10天組

8、相比較均有不同程度的減少，而NDGA組較EAE組減少得更加明顯。
　　3各組小鼠緊密連接蛋白的表達情況
　　3.1 claudin-5表達情況
　　3.1.1免疫組化法檢測給藥后第20d各組小鼠脊髓組織中claudin-5的表達情況:EAE組小鼠脊髓組織中claudin-5較正常對照組血管內(nèi)皮中的棕黃色顆粒較少且染色較淺、沒有形成連續(xù)的血管內(nèi)皮細胞，NDGA組較EAE組表達明顯增多。
　　3.1.2 confoc

9、al法檢測給藥后第20d各組小鼠腦組織中claudin-5的表達情況:正常對照組claudin-5陽性細胞連續(xù)分布于血管內(nèi)皮細胞胞漿中，EAE組與NDGA組claudin-5的連續(xù)性遭到破壞，且排列紊亂，但NDGA組較EAE組連續(xù)性破壞較輕。
　　3.2 occludin的表達情況
　　3.2.1免疫組化法檢測給藥后第20d各組小鼠脊髓組織中occludin的表達情況:EAE組小鼠脊髓組織中occludin較正常對照組血管內(nèi)

10、皮中的棕黃色顆粒較少且染色較淺、沒有形成連續(xù)的血管內(nèi)皮細胞，NDGA組較EAE組表達明顯增多。
　　3.2.2 con focal法檢測給藥后第20d各組小鼠腦組織中occludin的表達情況:正常對照組occludin陽性細胞連續(xù)分布于血管內(nèi)皮細胞胞漿中，EAE組與NDGA組occludin的連續(xù)性遭到破壞，且排列紊亂，但NDGA組較EAE組緊密連接蛋白的連續(xù)性破壞較輕。
　　3.3 ZO-1的表達情況
　　3.3.

11、1免疫組化法檢測給藥后第20d各組小鼠脊髓組織中ZO-1的表達情況:EAE組小鼠脊髓組織中ZO-1較正常對照組血管內(nèi)皮中的棕黃色顆粒較少且染色較淺、沒有形成連續(xù)的血管內(nèi)皮細胞，NDGA組較EAE組表達明顯增多。
　　3.3.2 confocal法檢測給藥后第20天各組小鼠腦組織中ZO-1的表達情況
　　正常對照組occludin陽性細胞連續(xù)分布于血管內(nèi)皮細胞胞漿中，EAE組與NDGA組occludin的連續(xù)性遭到破壞，且排列

12、紊亂，但NDGA組較EAE組緊密連接蛋白的連續(xù)性破壞較輕。
　　4各組小鼠MMP-9的表達情況
　　4.1免疫組化結(jié)果顯示:在給藥后第20天對照組的脊髓組織中均未見明顯的MMP-9陽性細胞。EAE組與NDGA組的小鼠脊髓組織均可見MMP-9在脊膜細胞和小血管內(nèi)皮細胞還有少量在膠質(zhì)細胞的胞質(zhì)中呈陽性表達。NDGA組與EAE組相比較，MMP-9陽性細胞中棕黃色顆粒染色較淺，數(shù)目較少。
　　4.2 RT-PCR檢測給藥后第1

13、0天、第20天脊髓組織中MMP-9 mRNA水平:與正常對照組相比較，EAE組與NDGA組各個時間的小鼠的MMP-9mRNA水平均有上調(diào)，其中NDGA組較EAE組表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5各組小鼠NF-κB的表達情況
　　RT-PCR檢測給藥后第10天、第20天脊髓組織中NF-κB mRNA水平:與正常對照組相比較，EAE組與NDGA組小鼠的NF-κB mRNA水平均有上調(diào)，NDGA組較EAE組