FoxM1及其抑制劑在喉癌生長轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：
　　1、研究在體外環(huán)境下抑制劑硫鏈絲菌肽下調(diào) FoxM1表達(dá)后對喉癌 Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、克隆形成能力的影響及其中的分子機(jī)制。
　　2、研究在體內(nèi)環(huán)境下抑制劑硫鏈絲菌肽下調(diào) FoxM1表達(dá)后對喉癌Hep-2細(xì)胞體內(nèi)生長的影響及分子機(jī)制。
　　3、研究通過RNA干擾下調(diào)FoxM1表達(dá)后對喉癌Hep-2細(xì)胞體外克隆形成能力，以及在體內(nèi)生長的影響。
　　方法：
　　1、運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶

2、鏈反應(yīng)（RT-PCR）法和免疫印跡（western blot）法檢測硫鏈絲菌肽對Hep-2細(xì)胞中FoxM1表達(dá)的影響。
　　2、運(yùn)用CCK-8法檢測硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1后對Hep-2細(xì)胞細(xì)胞活力的影響。
　　3、運(yùn)用CFSE作為探針染色Hep-2細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞增殖的影響。通過流式細(xì)胞儀檢測硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。運(yùn)用RT-PCR法和 wes

3、tern blot法檢測硫鏈絲菌肽下調(diào) FoxM1后對細(xì)胞周期蛋白cyclinD1和 cyclinE1的表達(dá)水平的影響。
　　4、運(yùn)用Annexin V-FITC/PI雙染法和流式細(xì)胞儀檢測硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞凋亡的影響。運(yùn)用Tunel法進(jìn)一步驗(yàn)證硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞凋亡的影響。運(yùn)用RT-PCR法和western blot法檢測硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1后對Bcl-2、Bax、p53的mRNA

4、和蛋白表達(dá)水平的影響。運(yùn)用JC-1作為探針染料，流式細(xì)胞儀檢測硫鏈絲菌肽下調(diào) FoxM1對 Hep-2細(xì)胞線粒體膜電位的影響。運(yùn)用 western blot法檢測鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞中細(xì)胞色素C、cleaved caspase-9、 cleaved caspase-3和 cleaved PARP的蛋白表達(dá)水平的影響。通過Annexin V-FITC/PI雙染法和流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)caspase抑制劑z-VAD-fmk預(yù)處

5、理后的硫鏈絲菌肽對Hep-2細(xì)胞凋亡的影響，以及通過western blot法檢測其中cleaved caspase-3的表達(dá)變化。運(yùn)用western blot法檢測鏈絲菌肽下調(diào) FoxM1對 Hep-2細(xì)胞中的 FADD、cleaved caspase-8、cIAP1、XIAP和 survivin蛋白表達(dá)水平的影響。
　　5、運(yùn)用侵襲實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)檢測硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。運(yùn)用RT-PCR

6、法和ELISA法檢測硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的mRNA表達(dá)水平，以及Hep-2細(xì)胞上清液中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平的影響。
　　6、運(yùn)用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞克隆形成能力的影響。
　　7、構(gòu)建裸鼠移植瘤模型觀察硫鏈絲菌肽下調(diào) FoxM1對 Hep-2細(xì)胞在體內(nèi)生長的影響。通過western blot法和免疫組織化學(xué)法檢測硫鏈絲菌肽作用后

7、對裸鼠腫瘤組織中FoxM1、Ki67和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響。
　　8、通過慢病毒侵染Hep-2細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FoxM1shRNA Hep-2細(xì)胞株。運(yùn)用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測RNA干擾下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞克隆形成能力的影響。運(yùn)用裸鼠移植瘤模型觀察 RNA干擾下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)腫瘤生長的影響。
　　結(jié)果：
　　1、經(jīng)硫鏈絲菌肽作用后Hep-2細(xì)胞中Fox

8、M1的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低。
　　2、硫鏈絲菌肽通過下調(diào)FoxM1表達(dá)抑制了Hep-2細(xì)胞細(xì)胞活力。
　　3、硫鏈絲菌肽通過下調(diào)FoxM1表達(dá)抑制了Hep-2細(xì)胞分裂增殖，將細(xì)胞周期阻滯于 S期，同時(shí)導(dǎo)致了細(xì)胞周期蛋白 cyclinD1和cyclinE1的表達(dá)下調(diào)。
　　4、硫鏈絲菌肽通過下調(diào) FoxM1促進(jìn)了 Hep-2細(xì)胞凋亡。硫鏈絲菌肽還下調(diào)Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax、p53表達(dá)，促使線粒體膜電位下降，

9、引起細(xì)胞色素C從線粒體中釋放到細(xì)胞胞漿中，激活cleaved caspase9、cleaved caspase-3和cleaved PARP，說明線粒體-caspase通路參與其中。其次，硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1還導(dǎo)致Hep-2細(xì)胞中FADD和cleaved caspase-8的蛋白表達(dá)水平增加，說明Fas信號通路參與其中。此外，硫鏈絲菌肽下調(diào) FoxM1還導(dǎo)致 IAP蛋白家族中 cIAP1、XIAP和survivin表達(dá)水平降低，說明

10、IAP蛋白家族也參與了該凋亡過程。
　　5、硫鏈絲菌肽下調(diào) FoxM1抑制了 Hep-2侵襲和遷移能力，并導(dǎo)致侵襲、轉(zhuǎn)移因子MMP-2和MMP-9的表達(dá)下調(diào)。
　　6、硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1抑制了Hep-2細(xì)胞克隆形成能力。
　　7、硫鏈絲菌肽下調(diào) FoxM1表達(dá)抑制了 Hep-2細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力，并發(fā)現(xiàn)硫鏈絲菌肽作用后引起腫瘤組織中Ki67蛋白表達(dá)水平下降，cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平增加。

11、
　　8、成功構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FoxM1shRNA Hep-2細(xì)胞株。RNA干擾下調(diào)FoxM1表達(dá)抑制了Hep-2細(xì)胞體外克隆形成能力，并抑制了Hep-2細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長能力。
　　結(jié)論：
　　1、硫鏈絲菌肽下調(diào) FoxM1抑制了喉癌細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能通過阻滯細(xì)胞于 S期，以及抑制細(xì)胞周期蛋白如 cyclinD1和 cyclinE1的表達(dá)。
　　2、硫鏈絲菌肽下調(diào) FoxM1促進(jìn)了喉癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能通過線粒