長效HIV融合抑制劑的設(shè)計(jì)、評價(jià)及其作用機(jī)制研究.pdf

1、多肽類HIV融合抑制劑——T20（藥品通用名:恩夫韋肽）已用于臨床治療艾滋病，但由于該多肽藥物半衰期短、藥效低、生產(chǎn)成本高，從而限制了其臨床應(yīng)用。近年來，一系列更高效率的多肽類HIV融合抑制劑，如T1144，被開發(fā)出來，然而其半衰期相對較短和生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)仍然是制約多肽HIV融合抑制劑藥物發(fā)展的瓶頸。如何設(shè)計(jì)長效且生產(chǎn)成本比多肽藥物低的非多肽HIV融合抑制劑成為未來HIV融合抑制劑研發(fā)領(lǐng)域的關(guān)鍵科學(xué)問題。
　　本研究設(shè)計(jì)出一個(gè)長

2、效的蛋白類HIV融合抑制劑——FLT(FN3-L35-T1144)。FLT是由三個(gè)蛋白片段（或多肽）組成，即FN3、L35和T1144。FN3為具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的擬抗體，其分子量小，可以與人血清白蛋白(Human SerumAlbumin)發(fā)生可逆性結(jié)合，從而達(dá)到延長體內(nèi)半衰期的作用。T1144為第三代多肽類HIV融合抑制劑，具有比T20更高效的抗HIV-1病毒活性。L35是由35個(gè)氨基酸構(gòu)成的連接肽，它把FN3和T1144連接在一起形成一

3、個(gè)新的蛋白類HIV融合抑制劑——FLT(FN3-L35-T1144)。我們的試驗(yàn)結(jié)果證明FLT具有高效、廣譜的抗HIV-1活性，在體內(nèi)的半衰期明顯延長。此外，F(xiàn)LT重組蛋白可以在大腸桿菌（原核系統(tǒng)）中大量可溶性地表達(dá)，大大降低了HIV融合抑制劑藥物生產(chǎn)成本。因此，使用擬抗體技術(shù)可顯著延長HIV融合抑制劑的半衰期，降低藥物的生產(chǎn)及治療成本，為解決多肽藥物的開發(fā)瓶頸提供新的解決方法。
　　本研究主要圍繞HIV融合抑制劑的長效性研究展開

4、，主要結(jié)論如下:
　　以pPBHFT-Fn3-FG和PGEX-6P-1MD1.1-L35-T1144質(zhì)粒為模板，成功構(gòu)建了重組蛋白FLT。目的蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中可獲得大量表達(dá)（絕大部分以上清表達(dá)為主，不溶的包涵體形式很少）。通過連接擬抗體FN3結(jié)構(gòu)域，可以促進(jìn)高度疏水序列T1144的原核表達(dá)產(chǎn)量。擬抗體FN3結(jié)構(gòu)域利用其自身的高表達(dá)性，作為分子伴侶促進(jìn)了T1144的折疊。每升大腸桿菌中，約可獲得重組蛋白20 mg以上，成功解決了

5、含多疏水性氨基酸序列蛋白的表達(dá)問題。本實(shí)驗(yàn)通過基因重組技術(shù)將不同功能的多肽連接，同時(shí)設(shè)計(jì)了一段富含親水性的氨基酸的小分子多肽連接序列——L35(G-G-G-G-S)7作為柔性序列，最大程度上解決空間位阻問題，從而得到具有雙功能的重組蛋白FLT。在HIV-1ⅢB和Bal病毒抑制實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)LT均在低納摩爾級表現(xiàn)出病毒抑制能力，其IC50值分別為11.39 nM和14.90 nM。重組蛋白FLT對臨床病毒株同樣表現(xiàn)出很強(qiáng)的病毒抑制能力。

6、>　　HIV-1融合抑制劑的主要作用機(jī)制是抑制病毒與靶細(xì)胞膜的融合，而HIV-1表面膜蛋白gp41六螺旋核心束的形成是gp41介導(dǎo)膜融合過程中的關(guān)鍵步驟。通過六螺旋競爭實(shí)驗(yàn)和熒光非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(FN-PAGE)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)重組蛋白FLT發(fā)揮高效抗病毒作用的機(jī)制是干擾gp41的NHR和CHR形成六螺旋核心束。
　　采用等溫滴定量熱技術(shù)(ITC)和表面等離子共振技術(shù)(SPR)檢測重組蛋白FLT在體外與人血清白蛋白的結(jié)合情況，得

7、到重組蛋白FLT與人血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)Ka為2.50×106，結(jié)合比為2.711。
　　本實(shí)驗(yàn)采用雙抗夾心ELISA法對FLT重組蛋白、T1144多肽及T20多肽進(jìn)行定量檢測。藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究表明，單次尾靜脈注射FLT蛋白后血清藥物濃度消除呈非線性消除。T20多肽的半衰期約為1.22±0.2h，T1144多肽的半衰期約為7.48±0.4 h，F(xiàn)LT重組蛋白的半衰期可達(dá)27.10±6.9 h，達(dá)到T20多肽半衰期的22.19倍，

8、T1144多肽半衰期的3.62倍。注射FLT蛋白、T1144多肽和T20多肽后，不同時(shí)間點(diǎn)的血清樣本對HIV-1病毒抑制效果呈現(xiàn)出與體內(nèi)藥物濃度相同趨勢變化。
　　同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)對下一代雙功能HIV融合抑制劑2DLT與抗艾滋病藥物的協(xié)同作用進(jìn)行研究，證實(shí)2DLT可以與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物組合使用具有互補(bǔ)和協(xié)同效應(yīng)，表明2DLT可進(jìn)一步開發(fā)成一個(gè)新的蛋白類抗HIV藥物，可與其他抗HIV藥物聯(lián)用來治療那些已對現(xiàn)有的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物產(chǎn)生高度耐