人α-LA與LacZ基因在牛乳腺上皮細(xì)胞中的共同表達(dá)研究.pdf

1、牛奶及其乳清中含有大量的乳糖，世界上平均70％～90％的成年人(尤其是亞洲和非洲入)喝牛奶后會(huì)產(chǎn)生乳糖不耐受，這在很大程度上限制了人們對(duì)乳及乳制品的攝入。β-半乳糖苷酶可將乳及乳清中的乳糖水解，降低乳糖含量，提高乳及乳制品的營養(yǎng)價(jià)值和利用率，解決乳糖不耐受患者的乳品消費(fèi)問題，同時(shí)還可去除乳清濃縮時(shí)乳糖結(jié)晶析出給乳制品加工帶來的不便。另外，牛乳和人乳在組成上是有差別的。人乳蛋白主要是乳清蛋白，約占總蛋白的70％，其他的為酪蛋白。而牛乳蛋白

2、主要是酪蛋白，約占總蛋白的78.8％，乳清蛋白含量低，約占總蛋白的21.2％。所以，改良牛乳的蛋白組成和含量，使之更接近于人乳，會(huì)提高牛乳的營養(yǎng)價(jià)值。用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變?nèi)槌煞謥硖岣呷榈臓I養(yǎng)價(jià)值和加工特性，包括提高乳中高價(jià)值成分的濃度、消除乳中不理想成分、生產(chǎn)人乳中一些成分以及利用乳腺生物反應(yīng)器來生產(chǎn)藥物蚩白，將為整個(gè)乳業(yè)生產(chǎn)帶來一場(chǎng)變革。α-乳白蛋白是一種主要的乳清蛋白，具有調(diào)節(jié)產(chǎn)乳的功能，是必需氨基酸和支鏈氨基酸的極好來源，也是唯一能與

3、金屬包括鈣結(jié)合的乳清蛋白成分。另外，它還有抑菌、抑制細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)大腦反應(yīng)能力等多種功能。本研究旨在通過基因重組技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)載體，使人α-乳白蛋白基因和β-半乳糖苷酶基因在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中高效表達(dá)，一方面降低乳糖含量，另一方面產(chǎn)生活性人α-乳白蛋白。目的在于進(jìn)一步使人α-乳白蛋白基因和β-半乳糖苷酶基因在奶牛乳腺中高水平表達(dá)，為今后制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因牛奶、改良牛奶品質(zhì)提供可行的技術(shù)手段和可信的理論支持。 ⑴PCR擴(kuò)增

4、了牛αS1-酪蛋白5’調(diào)控序列約1.2kb的片段，合成了0.76kb的人α-乳白蛋白的基因(α-LA)cDNA序列。應(yīng)用基因重組技術(shù)，以含SV40啟動(dòng)子調(diào)控下β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的PSV為載體，連接牛αS1-酪蛋白5'調(diào)控序列約1.2kb的片段為啟動(dòng)子，在其后連接0.76kb的人α-乳白蛋白基因cDNA序列，構(gòu)建了雙基因真核表達(dá)載體αS1-LA-psv。將人α-乳白蛋白(α-LA)0.76kb的cDNA序列連接到PSV載體SV

5、40啟動(dòng)子后(去LacZ基因)，構(gòu)建了SV40啟動(dòng)子調(diào)控下人α-乳白蛋白單基因真核表達(dá)載體LA-cDNA-psv；培養(yǎng)了牛乳腺上皮細(xì)胞，純化后。用免疫熒光細(xì)胞染色法對(duì)純化的牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行了角蛋白18鑒定，從而確定培養(yǎng)純化的細(xì)胞為奶牛乳腺上皮細(xì)胞。 ⑵用陽離子脂質(zhì)體將構(gòu)建的雙基因真核表達(dá)載體αS1-LA-psv轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞。應(yīng)用兩種方法檢測(cè)出了β-半乳糖苷酶在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)。一種方法是細(xì)胞原位染色法，表達(dá)的β

6、-半乳糖苷酶催化X-Gal分解，在顯微鏡下觀察到培養(yǎng)的細(xì)胞中生成了深藍(lán)色產(chǎn)物。另一種方法是用Promega生產(chǎn)的Beta-GloE2000檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)期細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解液中β-半乳糖苷酶的表達(dá)情況，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染24h～120h的細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解液中均檢測(cè)到了β-半乳糖苷酶的表達(dá)。其中在細(xì)胞破碎液中，轉(zhuǎn)染后24h就可以檢測(cè)到lacZ基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)染72h表達(dá)量最高，之后表達(dá)水平有逐漸降低的趨勢(shì)，144h降到最低，基本

7、檢測(cè)不到酶活性。在細(xì)胞培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)染后24h也可以檢測(cè)到lacZ基因的表達(dá)，但表達(dá)量明顯低于細(xì)胞破碎液，之后表達(dá)水平有逐漸升高的趨勢(shì)，48h達(dá)到最高，隨后開始降低，144h也基本檢測(cè)不到酶活性。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代后檢測(cè)β-半乳糖苷酶的表達(dá)情況，結(jié)果傳到第三代時(shí)基本檢測(cè)不到酶活性。應(yīng)用高效液相色譜(HLPC)檢測(cè)了轉(zhuǎn)染后不同時(shí)期細(xì)胞破碎液中β-半乳糖苷酶的表達(dá)所引起的細(xì)胞中乳糖含量的變化，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染24h乳糖含量變化不大，轉(zhuǎn)染48～144h

8、乳糖含量顯著減少，且在48h至72h乳糖的減少量最多，與β-半乳糖苷酶的含量檢測(cè)結(jié)果相符。轉(zhuǎn)染后，應(yīng)用WesternBlot方法檢測(cè)了人α-乳白蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染72h的細(xì)胞裂解液中檢測(cè)到了人α-乳白蛋白的表達(dá)，表達(dá)量約為0.64mg/mL。 ⑶將構(gòu)建的SV40啟動(dòng)子調(diào)控下人α-乳白蛋白基因的單基因真核表達(dá)載體LA-cDNA-psv用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞，也應(yīng)用WesternBlot方法檢測(cè)到了轉(zhuǎn)染72h

9、人α-乳白蛋白的表達(dá)，表達(dá)量約為0.85mg/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明培養(yǎng)的牛乳腺上皮細(xì)胞具有外源基因表達(dá)活性；得到的牛αS1-酪蛋白5’調(diào)控序列能作為啟動(dòng)子指導(dǎo)外源基因在牛乳腺上皮細(xì)胞高效表達(dá)；構(gòu)建的雙基因真核表達(dá)載體αS1-LA-psv能在體外培養(yǎng)的牛乳腺上皮細(xì)胞中高效表達(dá)人α-乳白蛋白和β-半乳糖苷酶；構(gòu)建的單基因真核表達(dá)載體LA-cDNA-psv能在體外培養(yǎng)的牛乳腺上皮細(xì)胞中高效表達(dá)人α-乳白蛋白。 ⑷用陽離子脂質(zhì)體將構(gòu)建的雙