水稻T-DNA插入突變?nèi)后w側(cè)翼序列的分離分析和OsaTRZ2的克隆與功能鑒定.pdf

1、水稻（Oryza sativa）是最重要的糧食作物之一。隨著水稻全基因組序列的測(cè)定，以解析水稻全部基因功能為目標(biāo)的功能基因組研究已成為水稻基因組學(xué)研究的重點(diǎn)。大型突變體庫(kù)是水稻功能基因組研究的重要技術(shù)平臺(tái)，插入突變?nèi)后w是這一平臺(tái)的一個(gè)主要技術(shù)支撐。由于插入突變體突變表型和基因型之間的關(guān)聯(lián)可以便捷地通過(guò)分離插入元件的側(cè)翼序列進(jìn)行鑒定，側(cè)翼序列分離便成為利用插入突變?nèi)后w進(jìn)行功能基因組研究的關(guān)鍵工作。tRNA是蛋白質(zhì)合成等多種生命活動(dòng)不可或缺

2、的重要組分。tRNA以前體形式轉(zhuǎn)錄，需要去除5'和3'端附加序列等一系列加工才能成為有活性的功能分子。目前植物中關(guān)于tRNA3'端加工的分子機(jī)制還所知甚少。本研究以本實(shí)驗(yàn)室建立的RMD大規(guī)模T-DNA插入突變體庫(kù)為材料，進(jìn)行了大量的側(cè)翼序列分離和突變表型篩選工作。在此基礎(chǔ)上，本研究結(jié)合農(nóng)桿菌侵染后6小時(shí)水稻愈傷組織的表達(dá)譜數(shù)據(jù)和72，090條側(cè)翼序列對(duì)T-DNA和Tos17插入位點(diǎn)的分布與序列特征進(jìn)行了分析，并對(duì)影響插入位點(diǎn)發(fā)掘的因素進(jìn)

3、行了推測(cè)。此外，本研究還利用一個(gè)白化苗突變體克隆和鑒定了一個(gè)參與葉綠體tRNA3'端加工的tRNase Z編碼基因，OsaTRZ2。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴完成了對(duì)2，037個(gè)T0代獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株的PCR陽(yáng)性檢測(cè)，陽(yáng)性率為85.7％。⑵使用TAIL-PCR、反向PCR和接頭PCR等方法從7，548份突變體材料中分離到5，711條可定位于水稻基因組上的T-DNA和Tos17側(cè)翼序列（E-value＜10-5）。⑶通過(guò)分析T-DNA

4、和Tos17插入位點(diǎn)在基因組不同層級(jí)上的分布發(fā)現(xiàn)中花11號(hào)和日本晴遺傳背景下T-DNA和Tos17插入位點(diǎn)分別展示出了相似的分布特征，表明不同粳稻遺傳背景下影響插入位點(diǎn)發(fā)掘的因素類似。⑷通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄活性分布與T-DNA或Tos17插入位點(diǎn)分布的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)T-DNA插入位點(diǎn)的分布在全基因組范圍內(nèi)，尤其在基因區(qū)內(nèi)，與染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄活性呈高度正相關(guān)。而Tos17插入位點(diǎn)的主要集中區(qū)有一半都位于染色質(zhì)上轉(zhuǎn)錄活性相對(duì)較低的區(qū)域，并且在基因區(qū)內(nèi)Tos1

5、7插入位點(diǎn)的分布與基因表達(dá)量呈高度負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果提示染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄活性是影響插入位點(diǎn)發(fā)掘的重要因素。⑸通過(guò)對(duì)插入位點(diǎn)臨近序列的核苷酸組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)在T-DNA和Tos17插入位點(diǎn)的3'下游都出現(xiàn)了AT含量的上升，但上升的程度與插入位點(diǎn)的數(shù)量呈反比，推測(cè)PCR技術(shù)對(duì)富含AT序列的偏愛(ài)是造成這種特征的原因。⑹通過(guò)對(duì)插入位點(diǎn)的核苷酸組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)G頻率在T-DNA左端插入位點(diǎn)5'上游5 bp范圍內(nèi)出現(xiàn)連續(xù)的2％左右的下降，而在T-DNA右端

6、插入位點(diǎn)5'上游3 bp到3'下游1 bp位置上出現(xiàn)了2％-7％左右的上升。T-DNA左右端插入位點(diǎn)這種特異而微弱的堿基偏愛(ài)與T-DNA的微同源整合機(jī)制相符合。Tos17右端插入位點(diǎn)處出現(xiàn)了強(qiáng)烈的堿基偏愛(ài)，其一致序列為ANGTTGNNNCAACNT，可能是由Tos17的整合機(jī)制造成的。⑺通過(guò)對(duì)11，469個(gè)T1代突變體家系的田間表型篩選獲得了105個(gè)表型穩(wěn)定的穗部突變體家系和149個(gè)葉色突變體家系，包括4個(gè)T-DNA插入與突變表型共分離

7、的家系:LT71、06LT90、LT30和OsaTRZ2。⑻OsaTRZ2是一個(gè)白化苗家系，osatrz2突變體發(fā)芽后存活不超過(guò)4周。色素和細(xì)胞學(xué)分析表明osatrz2的葉片缺乏葉綠素并且葉片中原質(zhì)體的發(fā)育停滯在向葉綠體轉(zhuǎn)化的早期階段，而osatrz2愈傷細(xì)胞中質(zhì)體的數(shù)量和大小也都極度降低。⑼RT-PCR和共分離檢測(cè)表明白化表型是由于T-DNA插入到OsaTRZ2的第7個(gè)外顯子中導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本被截短造成的?；蚪M注釋表明OsaTRZ2編碼一

8、個(gè)365氨基酸長(zhǎng)的tRNase Z。⑽遺傳互補(bǔ)和雙鏈RNA干涉實(shí)驗(yàn)證實(shí)OsaTRZ2的破壞是造成白化表型的原因。⑾表達(dá)分析和芯片數(shù)據(jù)表明OsaTRZ2在水稻組織中呈組成型表達(dá)，但在葉片、葉鞘和愈傷等綠色組織和活躍的分生組織中表達(dá)量較高。⑿亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明OsaTRZ2定位于葉綠體中。⒀體內(nèi)和體外酶活實(shí)驗(yàn)都表明OsaTRZ2具有切除tRNA前體3'端尾巴的活性。⒁對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的分析表明OsaTRZ2失活后質(zhì)體編碼的RNA聚合酶與細(xì)胞核編碼