根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)灰葡萄孢遺傳轉(zhuǎn)化及T-DNA側(cè)翼序列分析.pdf

1、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）既是危害經(jīng)濟(jì)作物的重要植物病原真菌，也是研究植物與微生物相互作用的重要模式生物之一，從全基因組水平分析研究該真菌關(guān)鍵基因的功能，可以加速對(duì)灰葡萄孢生物學(xué)及其致病分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為培育持久抗病品種和制定灰霉病持續(xù)管理的策略提供理論依據(jù)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，以其特有的優(yōu)點(diǎn)成為研究真

2、菌與其寄主互作的有力工具。
　　 本研究利用ATMT技術(shù)，創(chuàng)建了灰葡萄孢突變體，并對(duì)部分突變體進(jìn)行了分析，具體結(jié)果如下：
　　 （1）為獲得灰葡萄孢轉(zhuǎn)化子，對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了篩選轉(zhuǎn)化子最適潮霉素濃度為100 μg/mL，頭孢噻肟鈉與羧卞青霉素對(duì)農(nóng)桿菌有效抑制的濃度均為200 μg/mL。確定了共培養(yǎng)最佳方式是灰葡萄孢分生孢子和活化的根癌農(nóng)桿菌共同涂于玻璃紙上培養(yǎng)，共培養(yǎng)的最佳時(shí)間為48 h。應(yīng)用最

3、適的轉(zhuǎn)化條件，從105個(gè)分生孢子中平均獲得120～150個(gè)灰葡萄孢轉(zhuǎn)化子。
　　 （2）本試驗(yàn)已得到400多個(gè)轉(zhuǎn)化子，通過(guò)繼代培養(yǎng)初步證明插入到灰葡萄孢基因組中的潮霉素抗性基因可穩(wěn)定遺傳。對(duì)所獲得的部分轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR及Southern blot驗(yàn)證。根據(jù)T-DNA上已知潮霉素基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)的轉(zhuǎn)化子均含有目的潮霉素基因片段。隨機(jī)選取其中6個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行Southern blot驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6個(gè)

4、轉(zhuǎn)化子均有雜交信號(hào)，且其中5個(gè)為單拷貝插入。
　　 （3）通過(guò)TAIL-PCR技術(shù)，擴(kuò)增獲得T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列。對(duì)28個(gè)有效擴(kuò)增片段的序列分析結(jié)果表明，19個(gè)T-DNA邊界序列為灰葡萄孢序列，9個(gè)為載體主干序列。將定位的17個(gè)突變體與野生型菌株進(jìn)行生物學(xué)性狀比較，發(fā)現(xiàn)獲得的部分突變體在菌株顏色、菌核的有無(wú)、分生孢子形態(tài)及產(chǎn)孢量方面發(fā)生明顯變化。致病性測(cè)定結(jié)果表明，有1個(gè)突變體完全喪失致病能力。
　　 本文利用農(nóng)