PI3Kδ-RhoA通路在慢性阻塞性肺疾病小鼠肺巨噬細(xì)胞吞噬功能障礙中的作用.pdf

1、目的:慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞(AM)吞噬功能是降低的，且這種吞噬功能的降低與AM細(xì)胞骨架的異常重排有關(guān)；磷脂酰肌醇3-激酶δ(PI3Kδ)屬脂質(zhì)激酶，其可通過特異性負(fù)性調(diào)控Ras同源基因家族成員A(RhoA)而影響細(xì)胞骨架排列，然而PI3Kδ通過調(diào)控RhoA影響細(xì)胞骨架排列與慢阻肺AM吞噬功能低下的關(guān)系鮮見報道，故本研究以慢阻肺小鼠AM為研究對象，探討PI3Kδ-RhoA通路在慢阻肺小鼠AM吞噬功能障礙中的作用。

2、r>　　方法:40只SPF級8周齡雄性BALB/c小鼠，其中20只小鼠采用單純香煙煙霧暴露90天建立慢阻肺模型，對照組20只，造模結(jié)束后采用無創(chuàng)小鼠肺功能測量儀測定各組小鼠肺功能，用吸氣峰流速(PIF)、呼氣峰流速(PEF)和呼出50％潮氣量時的流速(EF50)表示；頸椎脫臼法處死小鼠，取肺組織行HE染色，觀察其病理學(xué)改變；不連續(xù)密度梯度離心法分離AM，并將其分為健康對照組、慢阻肺組、健康IC87114(PI3Kδ抑制劑)組、慢阻肺IC

3、87114組。噻唑蘭比色法(MTT)確定IC87114的最佳作用濃度和時間，健康IC87114組和慢阻肺IC87114組AM培養(yǎng)基中加入終濃度為1nmol/L IC87114干預(yù)24h；流式細(xì)胞術(shù)測AM吞噬異硫氰酸熒光素標(biāo)記的大腸桿菌(FITC-E.coli)的能力，用平均熒光強(qiáng)度(MFI)和吞噬FITC-E.coli陽性細(xì)胞百分比(吞噬%)表示；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法測定AM PI3K?及RhoA mRNA表達(dá)；蛋

4、白印記(Western Blot)法測定AM PI3Kδ及RhoA蛋白的表達(dá)；小G蛋白活性(G-LISA)試劑盒檢測AM RhoA活性；激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察AM細(xì)胞骨架形態(tài)學(xué)的變化。
　　結(jié)果:(1)小鼠肺功能及肺組織病理學(xué)改變：慢阻肺組PIF、PEF、EF50(7.06±0.52、4.24±0.29、3.27±0.36)明顯低于健康對照組(10.37±0.76、7.13±0.41、5.04±0.47)(均P<0.01)。

5、病理學(xué)改變：慢阻肺模型小鼠肺泡數(shù)目顯著減少，肺泡腔擴(kuò)大、融合成較大的囊腔，呈明顯肺氣腫改變，同時伴有大量炎性細(xì)胞浸潤，而健康對照組小鼠肺組織未見明顯上述病理學(xué)改變。
　　(2)AM吞噬能力檢測：慢阻肺組AM MFI和吞噬%：[4512±517、(32.19±4.57)%]顯著低于健康對照組[9857±1042、(68.53±2.88)%](均P<0.01)；慢阻肺IC87114組[6894±472、(50.63±2.12)%]較慢

6、阻肺組顯著升高(均P＜0.01)；健康IC87114組[10097±897、(70.99±3.86)%]較健康對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(3)AM PI3K?mRNA和蛋白的表達(dá)：慢阻肺組(3.41±0.54、0.84±0.08)較健康對照組(1.00±0.00、0.57±0.07)顯著增加(均P<0.01)；慢阻肺IC87114組(1.52±0.28、0.66±0.13)較慢阻肺組顯著降低(均P<0.01)；健康IC8711

7、4組(0.74±0.07、0.50±0.10)與健康對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(4)AM RhoA mRNA和蛋白的表達(dá)：慢阻肺組(0.70±0.07、0.41±0.10)較健康對照組(1.00±0.00、0.56±0.09)顯著降低(均P<0.01)；慢阻肺IC87114組(0.91±0.08、0.48±0.06)較慢阻肺組顯著增高(P<0.01或P<0.05)；健康IC87114組RhoA mRNA的表達(dá)(1.07±0.1

8、0)較健康對照組有所增加(P<0.05)，RhoA的蛋白表達(dá)(0.55±0.05)與健康對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　(5)AM RhoA活性：慢阻肺組RhoA活性(0.70±0.06)較健康對照組(1.19±0.09)顯著降低(P<0.01)；慢阻肺IC87114組RhoA活性(0.86±0.06)較慢阻肺組顯著增加(P<0.01)；健康IC87114組(1.25±0.05)與健康對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　(6)AM細(xì)

9、胞骨架變化：健康對照組和健康IC87114組AM變形明顯，伸出密集且較長的絲狀偽足，吞噬FITC-E.coli較多，慢阻肺組AM形態(tài)幾乎無變化，呈圓形或卵圓形，偽足伸出短小或缺失，吞噬FITC-E.coli較少；慢阻肺IC87114組可見AM變形增多，有偽足伸出，吞噬FITC-E.coli有所增加。
　　(7)相關(guān)性分析：各組小鼠AM PI3KδmRNA、蛋白表達(dá)與RhoA mRNA、蛋白表達(dá)及活性均呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01)；各組

10、小鼠PI3KδmRNA及蛋白表達(dá)與AM吞噬FITC-E.coli的MFI均呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01或P＜0.05)，各組小鼠AM RhoA mRNA、蛋白及活性與AM吞噬FITC-E.coli的MFI均呈正相關(guān)(P＜0.01或P＜0.05)。
　　結(jié)論:單純香煙煙霧暴露法可建立小鼠慢阻肺模型；慢阻肺小鼠AM吞噬功能降低，細(xì)胞骨架異常重排；PI3Kδ特異性調(diào)控RhoA，且兩者呈負(fù)相關(guān)；慢阻肺小鼠AM PI3Kδ過度活化致RhoA活性降