IBRV gC和gD基因的原核表達(dá)與真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、牛傳染性鼻氣管炎(infectiousbovinerhinotracheitis，IBR)是由Ⅰ型牛皰疹病毒(bobineherpesivirus-1，BH本研究利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出IBRVBarthaNu/67株gC和gD基因，并進(jìn)行了分子克隆，成功實現(xiàn)了gC和gD基因在大腸桿菌中的表達(dá)；同時構(gòu)建了gC和gD真核表達(dá)載體Bacmid，為今后的轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。 1.參照GenBank發(fā)表的IBRVBarthaNu/67株

2、基因序列，設(shè)計合成兩對引物，對BarthaNu/67株IBRVgC和gD基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增、克隆和測序。序列分析結(jié)果表明，本實驗已成功地獲得了IBRVBarthaNu/67株gC和gD基因序列，分別為1311bp和1251bp，與Genbank已發(fā)表的序列進(jìn)行比對分析結(jié)果顯示，gD基因序列只有一個核苷酸堿基變異，其同源性為99.82％，編碼的氨基酸的同源性為100％，即該堿基的突變并未引起編碼氨基酸的變化，gC基因序列同源性為100％

3、，編碼的氨基酸的同源性為100％。由此表明IBRV基因的高度保守性。根據(jù)對IBRVgC和gD基因分析，設(shè)計四對帶有酶切位點(diǎn)的引物，從克隆的pGEMT-gC和pGEMT-gD重組質(zhì)粒分段擴(kuò)增出原核表達(dá)片段，然后克隆到表達(dá)載體pET-32a和pGEX-4T-2中，經(jīng)EcoRI和BamHI酶切鑒定，得到陽性重組表達(dá)質(zhì)粒gC4THB和gCpETHB以及gD4TQ、gD4TQB、gD4THB和gDpETQ、gDpETQB、gDpETHB。

4、 2.將構(gòu)建的分段重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21(DE3)和BL21中，經(jīng)終濃度為2mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，其中g(shù)C4THB和gCpETHB以及gD4TQ、gD4TQB、gD4THB和gDpETQ高效表達(dá)了gC和gD分段基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白，并且gDpETQ、gD4TQ和gD4THB是可溶性蛋白，而gC4THB、gCpETHB和gD4TQB以包涵體形式存在。Western-Blot檢測表明，表達(dá)的重組蛋白能夠被IBRV陽性血清所