花生DGAT2基因的原核表達(dá)與亞細(xì)胞定位研究.pdf

1、花生是主要油料作物之一,同時也是重要的經(jīng)濟(jì)作物.我國是世界上主要的花生生產(chǎn)國家,產(chǎn)量占到世界總產(chǎn)量的40％.花生油作為一種比較容易消化的食用油,在我國食用油中占到30％.植物中三酰基甘油(TAG)是最主要的脂類儲存形式.二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)是TAG合成途徑中的關(guān)鍵酶,催化脂?；D(zhuǎn)移到二?；视?DAG)sn-3位上,并在此過程中起到限速作用.研究表明,DGAT的活性與油脂的積累速率以及含油量是呈正相關(guān).本實驗室從‘魯花14’中

2、已經(jīng)克隆得到兩種類型的DGAT2,分別命名為AhDGAT2a和AhDGAT2b,并從基因水平上進(jìn)行了相關(guān)的研究。本文著重從AhDGAT2蛋白的原核表達(dá)以及亞細(xì)胞定位兩方面進(jìn)行研究。由于從植物體內(nèi)提取純化蛋白比較困難,而且產(chǎn)量低,利用大腸桿菌表達(dá)目的基因獲得大量可溶性蛋白是一個方便快捷的方法.通過原核表達(dá)獲得AhDGAT2蛋白為抗體制備以及AhDGAT2功能研究提供了理論和實驗依據(jù).
　　pET28a-AhDGAT2原核表達(dá)載體構(gòu)建

3、及表達(dá):根據(jù) AhDGAT2基因的ORF和pET28a原核表達(dá)載體的酶切位點(diǎn)選用NcoI和XhoI作為插入位點(diǎn),將去掉終止密碼子的1002 bp的AhDGAT2的ORF插入到 pET28a原核表達(dá)載體,使AhDGAT2的C-端加上6×His Tag.pET28a-AhDGAT2重組載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌株,結(jié)果顯示沒有可溶性蛋白表達(dá).嘗試其他菌株 BL21(DE3)pLysS和Transetta(DE3),也未有可溶性蛋白表達(dá).可

4、能 pET28a原核表達(dá)載體不適合AhDGAT2的表達(dá).
　　pET28a-AhDGAT2(que)原核表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá):跨膜結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)AhDGAT2存在兩個跨膜區(qū). AhDGAT2(que)選用NcoI和XhoI作為酶切位點(diǎn)插入pET28a構(gòu)建pET28a-AhDGAT2(que)原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)誘導(dǎo)表達(dá).實驗結(jié)果顯示AhDGAT2(que)融合蛋白成功表達(dá).AhDGAT2a(que)融合蛋白分子

5、量約為33.78 kDa,AhDGAT2b(que)融合蛋白分子量約為33.82 kDa.從誘山東師范大學(xué)碩士論文導(dǎo)溫度和IPTG濃度兩方面優(yōu)化融合蛋白表達(dá)的條件,SDS-PAGE結(jié)果顯示,融合蛋白多以包涵體的形式存在.用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒從包涵體中純化到融合蛋白.
　　pGEX-4T-1-AhDGAT2原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá):pGEX-4T-1原核表達(dá)載體帶有一個26.97 kDa的GST標(biāo)簽蛋白.

6、GST-AhDGAT2a融合蛋白分子量約為64.47 kDa,GST-AhDGAT2b融合蛋白分子量約為64.51 kDa.本實驗中,以BamHI和XhoI為酶切位點(diǎn)將AhDGAT2的ORF插入pGEX-4T-1原核表達(dá)載體,分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Transetta(DE3)菌株誘導(dǎo)表達(dá).SDS-PAGE結(jié)果顯示,融合蛋白在3種菌株中均表達(dá).GST標(biāo)簽必需有活性才能與谷胱甘肽樹脂結(jié)合.因此,在融合蛋白

7、純化前對蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化是必需的.經(jīng)不同溫度和IPTG濃度誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)僅30℃時,在上清液和沉淀中均存在融合蛋白.蛋白純化結(jié)果顯示,融合蛋白主要以包涵體形式存在.
　　為了確定表達(dá)的AhDGAT2(que)和AhDGAT2蛋白在大腸桿菌中是否會起作用,我們對重組菌進(jìn)行了脂肪酸含量的測定.結(jié)果顯示,在BL21(DE3)中,重組菌的總脂肪酸含量均有所增加,但在Transetta(DE3)重組菌中,脂肪酸總含量卻是降低的.而且在這兩種

8、重組菌中,飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸均沒有各自的變化規(guī)律.
　　AhDGAT2的亞細(xì)胞定位:我們構(gòu)建了3種亞細(xì)胞定位載體pBSK-35S-AhDGAT2-EGFP,pBSK-35S-EGFP-AhDGAT2(que),pBSK-35S-AhDGAT2-RFP.通過基因槍轉(zhuǎn)化法使AhDGAT2a和AhDGAT2b在洋蔥表皮細(xì)胞中瞬時表達(dá),用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察.結(jié)果顯示,以EGFP作為報告基因時,這兩種蛋白在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜與細(xì)胞核