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文檔簡介
1、第一部分 EphB2在B細胞上表達及其作用的初步研究
背景:EphB2是受體型酪氨酸激酶 Eph家族成員,主要表達于腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞上,可促進腫瘤細胞增殖和遷移及內(nèi)皮細胞簇集。近年研究發(fā)現(xiàn),EphB2在T細胞和單核細胞上也有表達,并且其前向信號可促進T細胞遷移和單核細胞活化。然而,EphB2在B細胞上的表達及作用至今尚無明確報道。
方法:取健康志愿者靜脈血,分選出B淋巴細胞。分別利用LPS、anti-IgM和IL-
2、4刺激幼稚B細胞活化,以western blot檢測EphB2及其配體ephrinB1/B2蛋白表達情況。同時,通過轉(zhuǎn)染EphB2 siRNA以抑制EphB2表達,并設(shè)立陰性對照siRNA(NC)轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染對照組,檢測其對B細胞增殖、分泌細胞因子TNF-α及分泌IgG/IgM抗體水平的影響。
結(jié)果:EphB2及其特異性配體ephrinB1和ephrinB2在人外周血幼稚B細胞上均有表達,且體外刺激B細胞活化后,EphB2表
3、達顯著上調(diào)(P<0.05),而ephrinB1和ephrinB2表達均無明顯變化。同時,轉(zhuǎn)染siRNA并檢測B細胞活化指標,結(jié)果顯示,與NC轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染對照組相比,EphB2 siRNA轉(zhuǎn)染組B細胞增殖(P<0.05)、B細胞培養(yǎng)上清TNF-α(P<0.01)及IgG水平(P<0.05)均顯著下降,然而各組之間IgM水平無明顯差異。
結(jié)論:EphB2及其配體ephrinB1/B2在人B細胞上有表達,且EphB2在B細胞活化中
4、起到重要的促進作用。
第二部分調(diào)控B細胞EphB2表達的microRNA的篩選和鑒定
背景: microRNA是一種內(nèi)源性的、長度約為20-24個核苷酸的小RNA,通過與 mRNA特異性結(jié)合使其降解或抑制其翻譯為蛋白質(zhì),并因其穩(wěn)定性、保守性及靶向結(jié)合的特異性,成為疾病分子靶向治療方面的研究熱點。有研究顯示,在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞中,EphB2表達可受到多種microRNA的調(diào)控。因此,篩選出具有特異性調(diào)控 B
5、細胞 EphB2表達的 microRNA對進一步研究EphB2在B細胞中的作用機制有重要價值。
方法:利用miRWalk數(shù)據(jù)庫并綜合參考5種生物信息學(xué)分析結(jié)果,預(yù)測可調(diào)控人EphB2表達的microRNAs,并利用實時定量PCR檢測上述microRNAs在B細胞中的表達情況。之后,構(gòu)建含有EphB23’UTR結(jié)合位點的熒光霉素報告基因載體質(zhì)粒,并與miR-185模擬物或模擬物NC共轉(zhuǎn)染入工具細胞293T內(nèi),檢測各組細胞的熒光值
6、,以驗證miR-185是否可與EphB2 mRNA特異性結(jié)合并影響EphB2表達。另外,通過轉(zhuǎn)染miR-185模擬物和抑制劑進入B細胞,并western檢測B細胞EphB2蛋白水平、流式檢測EphB2(+)B細胞百分比和平均熒光強度,以進一步驗證miR-185是否可影響B(tài)細胞上EphB2的表達;同時,檢測B細胞增殖、分泌細胞因子TNF-α及分泌IgG/IgM抗體水平,以探究miR-185對B細胞活化的影響。
結(jié)果:miRWal
7、k數(shù)據(jù)庫預(yù)測出miRNA-185、miRNA-661、miRNA-593、miRNA-211、miRNA-515和miRNA-204這6種microRNA可調(diào)控人EphB2表達。上述6種microRNA在人外周血幼稚B細胞中均有表達,然而只有miRNA-185, miRNA-515和 miRNA-204在活化的 B細胞中表達下調(diào)( P<0.05),且與miRNA-515和miRNA-204相比,miRNA-185下調(diào)更為明顯(P<0.0
8、5)。熒光霉素報告基因結(jié)果顯示,含 EphB23’UTR野生型結(jié)合位點的報告基因與miRNA-185模擬物共轉(zhuǎn)染組細胞熒光測值下降41%(P<0.01)。進一步,我們分別轉(zhuǎn)染miR-185模擬物和抑制劑進入B細胞,檢測到與NC組和非轉(zhuǎn)染對照組相比,miR-185模擬物轉(zhuǎn)染組中western檢測B細胞EphB2蛋白水平、流式檢測EphB2(+)B細胞百分比和平均熒光強度均明顯下調(diào)(P<0.05),miR-185抑制劑轉(zhuǎn)染組中western
9、檢測B細胞EphB2蛋白水平、流式檢測EphB2(+)B細胞百分比和平均熒光強度均明顯上調(diào)(P<0.05);同時,我們檢測各組B細胞活化指標,結(jié)果顯示,miR-185模擬物轉(zhuǎn)染組B細胞增殖(P<0.05)、B細胞培養(yǎng)上清TNF-α(P<0.01)及IgG水平(P<0.05)均顯著下降,miR-185抑制劑轉(zhuǎn)染組B細胞增殖(P<0.05)、B細胞培養(yǎng)上清TNF-α(P<0.01)及IgG水平(P<0.05)均顯著上升。
結(jié)論:m
10、iR-185可特異性抑制B細胞上EphB2表達,從而阻礙B細胞活化。
第三部分EphB2調(diào)控B細胞活化的分子機制
背景:細胞活化的核心轉(zhuǎn)錄因子為NF-kB,其亞基p65是B細胞活化中的重要信號分子。在神經(jīng)細胞中,Src為EphB2下游的重要信號分子,可促進神經(jīng)突觸形成和重塑,且最近研究表明Src活化后可激活NF-kB(p65)分子。我們推測EphB2可能通過 Src-p65信號通路調(diào)控 B細胞活化。另外,一種新近發(fā)現(xiàn)
11、的信號分子Notch1可參與T細胞活化,但其在B細胞活化中的作用尚不明確。此部分我們將探究上述信號分子在EphB2調(diào)控B細胞活化中的作用。
方法:通過轉(zhuǎn)染EphB2 siRNA或miR-185模擬物寡聚核苷酸以抑制B細胞EphB2表達,western blot分別檢測B細胞phospho-Src/總Src、phospho-p65/總p65及Notch1蛋白水平,以探究EphB2調(diào)控B細胞活化中可能激活的信號通路。
結(jié)
12、果:與對照組相比,EphB2 siRNA和miR-185模擬物轉(zhuǎn)染組B細胞磷酸化Src表達顯著下調(diào)(P<0.05),各組B細胞總Src表達無明顯差異;磷酸化p65表達顯著下調(diào)(P<0.05),各組B細胞總p65表達無明顯差異。同時,EphB2 siRNA和miR-185模擬物轉(zhuǎn)染組B細胞中Notch1的表達受到顯著抑制(P<0.05)。
結(jié)論:EphB2可能通過Src-p65信號通路調(diào)控B細胞活化,Notch1也在其中發(fā)揮重要
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