OCILRP2在小鼠T細(xì)胞活化中的共刺激作用及其機(jī)制.pdf

1、背景：T淋巴細(xì)胞在體內(nèi)主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答,整個(gè)應(yīng)答過(guò)程分為三個(gè)階段:T細(xì)胞特異性識(shí)別抗原階段,T細(xì)胞活化、增殖和分化階段,T細(xì)胞應(yīng)答的效應(yīng)階段。T細(xì)胞共刺激在T細(xì)胞活化、增殖、分化和生存中發(fā)揮重要作用。
　　共刺激涉及效應(yīng)淋巴細(xì)胞表面配體受體的相互作用。破骨細(xì)胞抑制凝集素相關(guān)蛋白2(Osteoclast inhibit lectin related protein2, OCILRP2)基因最初從成骨細(xì)胞中分離獲得,它高表達(dá)于脾臟

2、、胸腺、B淋巴細(xì)胞、DC及活化的T細(xì)胞中,而靜止的T細(xì)胞中OCILRP2的表達(dá)水平很低。研究表明OCILRP2是小鼠T細(xì)胞活化共刺激中的一個(gè)重要的活化受體,其配體為NKRP1f。
　　OCILRP2是C型凝集素樣受體分子。C型凝集素樣受體分子在固有免疫及獲得性免疫應(yīng)答中通過(guò)與其配體結(jié)合而發(fā)揮重要的作用,其家族成員NKG2D缺少細(xì)胞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)基序,因而通過(guò)與不同的接頭蛋白結(jié)合激活NK細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞。OCILRP2蛋白胞內(nèi)段很短

3、,同樣缺少細(xì)胞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)基序,不能傳遞信號(hào),所以我們推測(cè)OCILRP2可能類(lèi)似于NKG2D,通過(guò)與跨膜接頭蛋白DAP12相互作用而活化下游信號(hào)通路。研究表明OCILRP2沉默的T細(xì)胞中酪氨酸磷酸化的lck減少,活化的T細(xì)胞中PI3-K的酪氨酸磷酸化不變。然而OCILRP2共刺激T細(xì)胞活化的確切機(jī)制及相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚不清楚。
　　目的：研究OCILRP2在小鼠T細(xì)胞活化過(guò)程中的共刺激作用及其機(jī)制,鑒定與OCILRP2發(fā)揮協(xié)同作用

4、的接頭蛋白,探索其介導(dǎo)T細(xì)胞活化的信號(hào)通路,豐富T細(xì)胞活化的共刺激理論,為深入理解T細(xì)胞活化的分子機(jī)制提供新線索。
　　方法：通過(guò)免疫共沉淀、GST pull down、激光共聚焦顯微鏡CLSM等實(shí)驗(yàn)鑒定與OCILRP2相互作用的接頭蛋白分子。構(gòu)建了全長(zhǎng)、胞內(nèi)段、胞外段加跨膜區(qū)重組OCILRP2蛋白,用來(lái)分析OCILRP2與接頭蛋白分子相互作用的區(qū)域。CD3/CD28抗體及PMA刺激小鼠T淋巴瘤EL4細(xì)胞,檢測(cè)刺激前后細(xì)胞因子的分

5、泌、細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期等生物學(xué)特征,運(yùn)用熒光定量 PCR技術(shù)檢測(cè)某些轉(zhuǎn)錄因子的變化,同時(shí)用免疫印跡技術(shù)尋找與OCILRP2相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了GST-DAP12、GST-OCILRP2胞內(nèi)段、GST-OCILRP2胞外段加跨膜區(qū)的融合蛋白,鑒定出OCILRP2與接頭蛋白分子DAP12相互作用,且只有胞外段加跨膜區(qū)的重組蛋白可與DAP12蛋白質(zhì)相互作用,DAP12與Ras不發(fā)生相互作用。
　　激光共

6、聚焦結(jié)果顯示OCILRP2與DAP12在EL4細(xì)胞膜上共定位。
　　靜止的EL4細(xì)胞系中OCILRP2主要在細(xì)胞漿中表達(dá),用CD3/CD28抗體激活的EL4細(xì)胞,受體由胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面,而用PMA處理的EL4細(xì)胞沒(méi)有表現(xiàn)出這種易位現(xiàn)象。DAP12經(jīng)抗體刺激前后其膜上蛋白表達(dá)情況不發(fā)生改變。
　　小鼠淋巴瘤細(xì)胞EL4在未受到任何刺激的情況下分泌IL-2的水平很低,經(jīng)CD3/CD28抗體刺激后,EL4分泌IL-2的水平顯著升高

7、。并且隨著CD3抗體濃度的升高和刺激時(shí)間的加長(zhǎng),IL-2的分泌水平也增高,摸索出CD3/CD28抗體刺激EL4細(xì)胞的最佳抗體濃度和刺激時(shí)間。不同處理組對(duì)EL4細(xì)胞進(jìn)行刺激48h,發(fā)現(xiàn)加入了OCILRP2抗體組的IL-2的分泌水平有所降低。CD3/CD28抗體濃度增加,對(duì)EL4細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用,加入OCILRP2抗體組與沉默組EL4增殖情況較CD3/CD28抗體減慢。而加入外源性IL-2抗體并不影響EL4細(xì)胞的增殖。OCILRP2不影響