EphB信號(hào)在軸向仿生壓應(yīng)力調(diào)控MSC成骨分化中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　臨床實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)室研究表明，不同強(qiáng)度的壓應(yīng)力對(duì)骨的生理、病理活動(dòng)產(chǎn)生不同的影響，但遠(yuǎn)未能闡明其機(jī)制。因此，深入研究壓應(yīng)力調(diào)控骨組織生理、病理活動(dòng)的分子機(jī)制，尋找壓應(yīng)力促進(jìn)或抑制成骨的轉(zhuǎn)化條件，對(duì)臨床上正確運(yùn)用壓應(yīng)力具有重要的指導(dǎo)意義，并有望為探索骨傷病的療法提供新思路。由于體內(nèi)力學(xué)環(huán)境和生化環(huán)境過(guò)于復(fù)雜，難以得出可重復(fù)的結(jié)果，該領(lǐng)域的研究多采用體外應(yīng)力環(huán)境。目前的商品化或自制的生物反應(yīng)器普遍不能提供精確的仿生應(yīng)力環(huán)境，也

2、難以提供長(zhǎng)期穩(wěn)定的培養(yǎng)基生化環(huán)境，成為該研究領(lǐng)域的技術(shù)瓶頸。肝配蛋白ephrin及其受體Eph(ephrinreceptor)家族近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)參與了骨骼發(fā)育、重塑和骨相關(guān)疾病的調(diào)控，可能成為我們深入認(rèn)識(shí)應(yīng)力調(diào)控骨生理、病理活動(dòng)機(jī)制的新線索。本研究采用反饋調(diào)節(jié)的設(shè)計(jì)思路，制作了一款可以為粘彈性生物材料和組織提供精確拉伸應(yīng)力和壓應(yīng)力的新型生物反應(yīng)器，以此為基礎(chǔ)研究了體外三維仿生培養(yǎng)環(huán)境中間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcell

3、，MSC)成骨分化的調(diào)控因素，以及EphB4、B6參與力學(xué)、化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化并調(diào)控MSC成骨分化的機(jī)制。
　　方法：
　　1、本研究著重改進(jìn)生物反應(yīng)器的施力功能，在施力裝置中整合柔性元件，用于施力器和組織之間的拉、壓應(yīng)力傳遞，消除剛性接觸導(dǎo)致的應(yīng)力突變、瞬態(tài)過(guò)沖。根據(jù)脛骨平臺(tái)下松質(zhì)骨與跟腱的受力模型編寫(xiě)仿生應(yīng)力控制軟件，為新型施力裝置提供反饋控制環(huán)路。改進(jìn)培養(yǎng)基生化環(huán)境控制系統(tǒng)，包括中空纖維半透膜重新選材，優(yōu)化了物質(zhì)交換器內(nèi)部液

4、流途徑，優(yōu)化pH、PO2、PCO2的控制程序。
　　2、將組織工程骨分為靜置培養(yǎng)、單純應(yīng)力培養(yǎng)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)三組，以檢測(cè)生物反應(yīng)器的仿生應(yīng)力環(huán)境和生化環(huán)境對(duì)三維培養(yǎng)細(xì)胞的影響。
　　3、用PCR檢測(cè)MSC成骨分化后的ephrin、Eph家族表達(dá)變化，確定EphB6為主要研究對(duì)象后，通過(guò)配體激活、siRNA、過(guò)表達(dá)研究其對(duì)MSC成骨分化的調(diào)控作用。為了解EphB6的下游信號(hào)，檢測(cè)RhoA磷酸化水平，并用ROCK抑制劑阻斷RhoA-

5、ROCK通路。
　　4、在生物反應(yīng)器工作參數(shù)中明確定義適度壓應(yīng)力、過(guò)度壓應(yīng)力，用免疫共沉淀、激光共聚焦研究EphB4、EphB6與整合素β亞基是否發(fā)生聯(lián)系，用免疫共沉淀檢測(cè)EphB與整合素β亞基是否與其他蛋白形成復(fù)合體。用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)EphB與整合素β亞基是否有直接接觸及可能的結(jié)合位點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　1、在施力裝置中整合柔性元件，實(shí)現(xiàn)對(duì)具有粘彈性的組織和生物材料均勻、穩(wěn)定施力。通過(guò)有限元技術(shù)獲得人體組織承受生

6、物應(yīng)力的仿生模型，并以此為依據(jù)編寫(xiě)了仿生應(yīng)力控制軟件。同時(shí)改進(jìn)物質(zhì)交換系統(tǒng)，使培養(yǎng)基的生化指標(biāo)在預(yù)設(shè)的范圍內(nèi)長(zhǎng)期保持穩(wěn)定。
　　2、改進(jìn)后的生物反應(yīng)器能促進(jìn)組織工程骨中的MSC增殖和成骨分化。在仿生壓應(yīng)力的作用下，三維支架里的細(xì)胞排列有序，細(xì)胞骨架伸展方向一致，表明該生物反應(yīng)器能夠?yàn)榻M織工程骨提供三維應(yīng)力環(huán)境，為后繼實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　3、定量PCR和免疫熒光染色表明EphB6在MSC成骨分化時(shí)表達(dá)下調(diào)。EphB6與配體e

7、phrinB1結(jié)合后使ALP活性和Runx2表達(dá)降低。siRNA沉默EphB6使MSC的Runx2表達(dá)上調(diào)，ALP活性增高，鈣結(jié)節(jié)染色增強(qiáng)，而過(guò)表達(dá)EphB6則出現(xiàn)相反的結(jié)果。但上述基因操作均不會(huì)影響MSC的成軟骨分化和成脂肪分化。
　　4、RhoA的磷酸化水平與成骨分化呈負(fù)相關(guān)，受到EphB6 siRNA干擾的細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天有更多GTP-RhoA，而過(guò)表達(dá)的細(xì)胞則顯著減少。在MSC成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加ROCK抑制劑Y-

8、27632，發(fā)現(xiàn)Runx2的表達(dá)上調(diào)，在siRNA干擾和過(guò)表達(dá)EphB6的細(xì)胞中也同樣檢測(cè)到Runx2的表達(dá)上調(diào)。
　　5、本研究在自制的生物反應(yīng)器上將0.5Hz、峰值10％形變的仿生壓應(yīng)力定義為適度壓應(yīng)力，0.5Hz、峰值20％形變的仿生壓應(yīng)力將過(guò)度壓應(yīng)力，并證實(shí)適度壓應(yīng)力下組織工程骨的ALP活性和Runx2表達(dá)增強(qiáng)，能促進(jìn)MSC成骨分化，而過(guò)度壓應(yīng)力則會(huì)抑制MSC成骨分化。由此為后續(xù)研究確立了力學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。
　　6、在適度壓

9、應(yīng)力下，EphB4與整合素β1形成免疫共沉淀，過(guò)度壓應(yīng)力下EphB6與整合素β3形成免疫共沉淀。激光共聚焦觀察到，適度壓應(yīng)力下EphB4與整合素β1共同分布在細(xì)胞膜的部分區(qū)域，并且被募集到F-actin的起始端。而EphB6則在過(guò)度壓應(yīng)力下與整合素β3共同分布在細(xì)胞膜上，且募集到F-actin的起始端。
　　7、FAK、Vinculin和Paxilin在適度壓應(yīng)力和過(guò)度壓應(yīng)力下均與EphB4形成了免疫共沉淀，但不與EphB6發(fā)生聯(lián)

10、系。
　　8、生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)EphB與整合素β亞基可能有直接聯(lián)系。EphB6可能的結(jié)合位點(diǎn)序列是230-290、362-393、555-580、610-635，整合素β3可能的結(jié)合位點(diǎn)序列是189-204、284-313。
　　結(jié)論：
　　1、該新型生物反應(yīng)器配合仿生應(yīng)力控制軟件和物質(zhì)交換系統(tǒng)，能夠?yàn)榻M織和三維生物材料提供精確仿生的應(yīng)力培養(yǎng)環(huán)境。
　　2、EphB6抑制MSC成骨分化，可能是通過(guò)提高RhoA磷

11、酸化水平來(lái)發(fā)揮作用的。沉默表達(dá)或過(guò)表達(dá)EphB6基因操作均不會(huì)影響MSC的成軟骨分化和成脂肪分化，可見(jiàn)EphB6是特異性地抑制MSC的成骨分化能力，而不是弱化其分化潛能。
　　3、本研究在自制的生物反應(yīng)器上定義了適度壓應(yīng)力和過(guò)度壓應(yīng)力，為后續(xù)研究確立了力學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)現(xiàn)在不同強(qiáng)度壓應(yīng)力下EphB4、B6分別與整合素β1、β3發(fā)生聯(lián)系，且EphB4、B6被募集到F-actin的起始端。由此推測(cè)，在應(yīng)力環(huán)境下，整合素與F-actin（即細(xì)