脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后組織中神經(jīng)元細(xì)胞的大量崩解、壞死，是導(dǎo)致患者損傷節(jié)段以下肢體運(yùn)動、感覺等功能障礙的重要原因之一。如何促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的再生以恢復(fù)脊髓的結(jié)構(gòu)與功能一直以來都是國內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)研究者們關(guān)注的重點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　近年來，隨著內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(endogenous neural stem cells，ENSCs)這一概念的提出，為脊髓損傷的再生修復(fù)帶來希望。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞存在于

2、脊髓中央管以及其周圍。各種程度的SCI致傷后，這些部位的細(xì)胞表現(xiàn)出不同程度的增殖、遷移、分化等干細(xì)胞樣反應(yīng)。但是在未經(jīng)干預(yù)的狀態(tài)下，這些ENSCs遷移距離短、增殖有限、分化也多以GFAP陽性的星型膠質(zhì)細(xì)胞為主而不能有效的分化為功能性的神經(jīng)元細(xì)胞以促進(jìn)損傷脊髓得到完全再生。因此，探究影響內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的分子機(jī)制可為從分子水平上調(diào)控ENSCs以治療脊髓損傷提供理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem c

3、ells，NSCs)在分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的過程中，受到許多因子的調(diào)控。Notch就在調(diào)控干細(xì)胞增殖方面作用重大。而bHLH家族的因子在調(diào)控神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的分化亞型上有決定性作用。激活型bHLH家族因子包括Mash、Math、Ngn、Olig等，而抑制型因子主要包括Hes1/3/5等。NSCs在分化過程中，激活型因子高表達(dá)則會促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元細(xì)胞分化;抑制型基因高表達(dá)時(shí)則保持神經(jīng)干細(xì)胞的干細(xì)胞特性，并促進(jìn)NSCs向膠質(zhì)細(xì)胞分化。

4、但是在脊髓損傷后這些因子的變化規(guī)律且與ENSCs增殖分化的關(guān)系尚少見報(bào)道。
　　因此，我們首先通過側(cè)腦室注射法觀察DIL熒光標(biāo)記液對ENSCs的標(biāo)記，然后利用輕度脊髓損傷模型研究ENSCs的增殖分化情況，最后我們利用分子生物學(xué)的方法初步分析了Nocth1和bHLH家族部分轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化及其對ENSCs的可能調(diào)控機(jī)制做一探討。
　　主要方法:
　　1.利用立體定位儀，從大鼠側(cè)腦室注射熒光標(biāo)記物DAPI或DIL各10μ

5、l，觀察大鼠的神經(jīng)功能狀態(tài)，然后于不同時(shí)間點(diǎn)灌注取材，比較兩種熒光標(biāo)記物對大鼠ENSCs的標(biāo)記情況。
　　2.利用Allen's打擊儀，以109·12.5 mm打擊力度制備大鼠輕度SCI模型。通過BBB評分和誘發(fā)電位檢測評價(jià)SCI后大鼠的后肢運(yùn)動功能與神經(jīng)傳導(dǎo)速度。HE染色觀察脊髓組織的損傷情況與室管膜細(xì)胞的數(shù)量變化。最后通過免疫熒光雙標(biāo)檢測脊髓損傷后不同時(shí)間ENSCs向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的分化情況。
　　3.利用RT-PCR

6、、Western-blot、免疫熒光雙標(biāo)檢測Notch1與bHLH家族的Hes1、Ngn2、Olig2等轉(zhuǎn)錄因子在SCI后的動態(tài)表達(dá)變化，探討其調(diào)控ENSCs增殖、分化的可能機(jī)制。
　　主要結(jié)果:
　　1.DAPI對于腦室各區(qū)的室管膜可以獲得良好的標(biāo)記，脈絡(luò)膜也獲得顯影，但是所有時(shí)間點(diǎn)均未見延髓及以下節(jié)段脊髓室管膜細(xì)胞被標(biāo)記。DIL在注射24小時(shí)后即可以使腦室和脊髓室管膜獲得良好的標(biāo)記。DAPI和DIL標(biāo)記持續(xù)時(shí)間較久，在標(biāo)

7、記后14天依然未見明顯衰減(均P＞0.05)。
　　2.神經(jīng)功能評價(jià)結(jié)果顯示:側(cè)腦室注射熒光標(biāo)記物DAPI或DIL是一項(xiàng)安全，無害的操作，注射后對大鼠的神經(jīng)功能無顯著影響。
　　3.輕度Allen's打擊模型依然能造成大鼠明顯的后肢功能癱瘓，BBB評分及電生理MEP檢測與正常組相比具有顯著差異。損傷后病理染色可見脊髓組織明顯出血、組織斷離以及空洞形成等改變，同時(shí)在損傷周圍組織有星型膠質(zhì)瘢痕形成。大鼠在SCI后出現(xiàn)一定的恢復(fù)，

8、但恢復(fù)程度有限，未達(dá)正常水平。
　　4.SCI后脊髓室管膜細(xì)胞表達(dá)BrdU和Nestin明顯增加，且出現(xiàn)明顯增殖、短距遷移等表現(xiàn)。增生的室管膜細(xì)胞的主要分化為GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)可見其分化為β-tubulinⅢ陽性的新生神經(jīng)元，但數(shù)量明顯少于分化的星形膠質(zhì)(P＜0.05)。
　　5.RT-PCR與Western-blot檢測發(fā)現(xiàn):以激活型基因?yàn)橹鞯腘gn2和Olig2在SCI后1、3天出現(xiàn)短暫的上調(diào)(P＜0.05

9、)，其后顯著降低且持續(xù)到14天(P＜0.05);而Notch1和以抑制性基因?yàn)橹鞯腍es1在SCI后出現(xiàn)上調(diào)，且持續(xù)到損傷后14天(P＜0.05)。
　　6.免疫雙標(biāo)觀察到:脊髓損傷后中央管室管膜及周圍出現(xiàn)Notch1與Hes1共表達(dá)細(xì)胞，β-tubulinⅢ與Ngn2共表達(dá)細(xì)胞，GFAP與Hes1共表達(dá)細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　1.DIL熒光標(biāo)記物適合腦和脊髓室管膜內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記，DAPI則僅適合腦室內(nèi)室管膜內(nèi)

10、源性神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記。它們的標(biāo)記時(shí)間均持續(xù)較久而無明顯泯滅。
　　2.大鼠輕度脊髓損傷能引起脊髓室管膜ENSCs的增殖與分化，但增生的ENSCs在自然狀態(tài)下主要分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，分化為神經(jīng)元的數(shù)量很少。這可能是SCI后自我修復(fù)能力差的重要原因之一。
　　3.Notch信號通路和bHLH家族基因在SCI后的表達(dá)變化與ENSCs增殖分化有著重要的聯(lián)系，其中Notch1和抑制性bHLH因子Hes1的持續(xù)高表達(dá)以及激活型bHLH因