脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖與分化及相關(guān)機制研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩73頁未讀 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)

文檔簡介

1、脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后組織中神經(jīng)元細胞的大量崩解、壞死,是導(dǎo)致患者損傷節(jié)段以下肢體運動、感覺等功能障礙的重要原因之一。如何促進神經(jīng)細胞的再生以恢復(fù)脊髓的結(jié)構(gòu)與功能一直以來都是國內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)研究者們關(guān)注的重點和難點。
  近年來,隨著內(nèi)源性神經(jīng)干細胞(endogenous neural stem cells,ENSCs)這一概念的提出,為脊髓損傷的再生修復(fù)帶來希望。實驗證實,內(nèi)源性神經(jīng)干細胞存在于

2、脊髓中央管以及其周圍。各種程度的SCI致傷后,這些部位的細胞表現(xiàn)出不同程度的增殖、遷移、分化等干細胞樣反應(yīng)。但是在未經(jīng)干預(yù)的狀態(tài)下,這些ENSCs遷移距離短、增殖有限、分化也多以GFAP陽性的星型膠質(zhì)細胞為主而不能有效的分化為功能性的神經(jīng)元細胞以促進損傷脊髓得到完全再生。因此,探究影響內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖、分化的分子機制可為從分子水平上調(diào)控ENSCs以治療脊髓損傷提供理論依據(jù)與實驗依據(jù)。
  神經(jīng)干細胞(neural stem c

3、ells,NSCs)在分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的過程中,受到許多因子的調(diào)控。Notch就在調(diào)控干細胞增殖方面作用重大。而bHLH家族的因子在調(diào)控神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的分化亞型上有決定性作用。激活型bHLH家族因子包括Mash、Math、Ngn、Olig等,而抑制型因子主要包括Hes1/3/5等。NSCs在分化過程中,激活型因子高表達則會促進NSCs向神經(jīng)元細胞分化;抑制型基因高表達時則保持神經(jīng)干細胞的干細胞特性,并促進NSCs向膠質(zhì)細胞分化。

4、但是在脊髓損傷后這些因子的變化規(guī)律且與ENSCs增殖分化的關(guān)系尚少見報道。
  因此,我們首先通過側(cè)腦室注射法觀察DIL熒光標記液對ENSCs的標記,然后利用輕度脊髓損傷模型研究ENSCs的增殖分化情況,最后我們利用分子生物學(xué)的方法初步分析了Nocth1和bHLH家族部分轉(zhuǎn)錄因子的表達變化及其對ENSCs的可能調(diào)控機制做一探討。
  主要方法:
  1.利用立體定位儀,從大鼠側(cè)腦室注射熒光標記物DAPI或DIL各10μ

5、l,觀察大鼠的神經(jīng)功能狀態(tài),然后于不同時間點灌注取材,比較兩種熒光標記物對大鼠ENSCs的標記情況。
  2.利用Allen's打擊儀,以109·12.5 mm打擊力度制備大鼠輕度SCI模型。通過BBB評分和誘發(fā)電位檢測評價SCI后大鼠的后肢運動功能與神經(jīng)傳導(dǎo)速度。HE染色觀察脊髓組織的損傷情況與室管膜細胞的數(shù)量變化。最后通過免疫熒光雙標檢測脊髓損傷后不同時間ENSCs向神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的分化情況。
  3.利用RT-PCR

6、、Western-blot、免疫熒光雙標檢測Notch1與bHLH家族的Hes1、Ngn2、Olig2等轉(zhuǎn)錄因子在SCI后的動態(tài)表達變化,探討其調(diào)控ENSCs增殖、分化的可能機制。
  主要結(jié)果:
  1.DAPI對于腦室各區(qū)的室管膜可以獲得良好的標記,脈絡(luò)膜也獲得顯影,但是所有時間點均未見延髓及以下節(jié)段脊髓室管膜細胞被標記。DIL在注射24小時后即可以使腦室和脊髓室管膜獲得良好的標記。DAPI和DIL標記持續(xù)時間較久,在標

7、記后14天依然未見明顯衰減(均P>0.05)。
  2.神經(jīng)功能評價結(jié)果顯示:側(cè)腦室注射熒光標記物DAPI或DIL是一項安全,無害的操作,注射后對大鼠的神經(jīng)功能無顯著影響。
  3.輕度Allen's打擊模型依然能造成大鼠明顯的后肢功能癱瘓,BBB評分及電生理MEP檢測與正常組相比具有顯著差異。損傷后病理染色可見脊髓組織明顯出血、組織斷離以及空洞形成等改變,同時在損傷周圍組織有星型膠質(zhì)瘢痕形成。大鼠在SCI后出現(xiàn)一定的恢復(fù),

8、但恢復(fù)程度有限,未達正常水平。
  4.SCI后脊髓室管膜細胞表達BrdU和Nestin明顯增加,且出現(xiàn)明顯增殖、短距遷移等表現(xiàn)。增生的室管膜細胞的主要分化為GFAP陽性的星形膠質(zhì)細胞,同時可見其分化為β-tubulinⅢ陽性的新生神經(jīng)元,但數(shù)量明顯少于分化的星形膠質(zhì)(P<0.05)。
  5.RT-PCR與Western-blot檢測發(fā)現(xiàn):以激活型基因為主的Ngn2和Olig2在SCI后1、3天出現(xiàn)短暫的上調(diào)(P<0.05

9、),其后顯著降低且持續(xù)到14天(P<0.05);而Notch1和以抑制性基因為主的Hes1在SCI后出現(xiàn)上調(diào),且持續(xù)到損傷后14天(P<0.05)。
  6.免疫雙標觀察到:脊髓損傷后中央管室管膜及周圍出現(xiàn)Notch1與Hes1共表達細胞,β-tubulinⅢ與Ngn2共表達細胞,GFAP與Hes1共表達細胞。
  結(jié)論:
  1.DIL熒光標記物適合腦和脊髓室管膜內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的標記,DAPI則僅適合腦室內(nèi)室管膜內(nèi)

10、源性神經(jīng)干細胞的標記。它們的標記時間均持續(xù)較久而無明顯泯滅。
  2.大鼠輕度脊髓損傷能引起脊髓室管膜ENSCs的增殖與分化,但增生的ENSCs在自然狀態(tài)下主要分化為星形膠質(zhì)細胞,分化為神經(jīng)元的數(shù)量很少。這可能是SCI后自我修復(fù)能力差的重要原因之一。
  3.Notch信號通路和bHLH家族基因在SCI后的表達變化與ENSCs增殖分化有著重要的聯(lián)系,其中Notch1和抑制性bHLH因子Hes1的持續(xù)高表達以及激活型bHLH因

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論