親和色譜材料的制備及在糖蛋白-糖肽分離分析中的應(yīng)用研究.pdf

1、博士學(xué)位論文親和色譜材料的制備及在糖蛋白／糖肽分離分析中的應(yīng)用研究Preparationofaffinitychromatographicmaterialsfortheseparationandanalysisofglycoproteins／glycopeptides學(xué)11l07100大連理工大學(xué)DalianUniversityofTechnology大連理工大學(xué)博士學(xué)位論文摘要糖基化修飾是最常見和最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，在真核生

2、物中，大約50％的蛋白質(zhì)發(fā)生了糖基化。糖基化參與了多種生命活動(dòng)，包括細(xì)胞生長、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、免疫反應(yīng)和細(xì)胞間的交流等。文獻(xiàn)報(bào)道，異常糖基化和癌癥、人類免疫缺陷病毒和免疫失調(diào)等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可被應(yīng)用于診斷和預(yù)測疾病及其病理的發(fā)展過程，需要發(fā)展分離糖蛋白糖肽的新型材料和開發(fā)相應(yīng)的分離分析方法。本論文致力于發(fā)展簡單、經(jīng)濟(jì)和高效的方法制備以硅膠為基質(zhì)的親和固定相，并發(fā)展相應(yīng)的色譜分離方法，用于富集和分離糖蛋白／糖肽。針對(duì)傳統(tǒng)

3、方法中制備親和固定相所存在的不耐高壓和材料親和容量低的問題，我們改用硅膠為基質(zhì)，在硅膠表面高效鍵合親水性的羧基官能團(tuán)，經(jīng)過碳化二亞胺(EDC)矛IN羥基琥珀酰亞胺(NHS)的活化，鍵合了伴刀豆凝集素(ConA)，得到SGConA色譜固定相。相比較于商品化的以凝膠為基質(zhì)的凝集素材料AgaroseConA，SGConA色譜固定相在高效液相色譜模式下，能夠高效富集含有復(fù)合型聚糖的卵清蛋(了(ovalbumin)和含有高甘露糖型聚糖的核糖核酸酶

4、B(RNaseB)，表現(xiàn)出高效富集糖蛋白糖肽的特點(diǎn)，以及在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的應(yīng)用潛力。傳統(tǒng)的方法制備凝集素材料，存在非特異性吸附的缺點(diǎn)。因此，本文使用氧化葡聚糖為間隔臂，合成了一種以硅膠為基質(zhì)的ConA材料(Si02ODexConA)用于富集糖蛋白／糖肽。為了比較，我們同時(shí)按照傳統(tǒng)制備ConA固定相的方法，以環(huán)氧丙基硅烷為起始間隔臂，制備了另一種以硅膠為基質(zhì)的Si02AidConA材料。相比較于Si02AidConA材料，Si02ODe

5、xConA材料依靠氧化葡聚糖的柔韌性和親水性的優(yōu)勢，在吸附糖蛋白o(hù)valbumin的過程中展現(xiàn)出較低的非特異性吸附和高結(jié)合容量的特點(diǎn)。在高效色譜模式下，Si02ODexConA材料可以高效富集高甘露糖型和雙天線復(fù)合型聚糖的糖蛋白／糖肽，并且Si02ODexConA材料可以用于從復(fù)雜樣品中選擇性的富集糖蛋白，體現(xiàn)出在蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用中的潛力。目前，針對(duì)抗體藥物的日益增長需求，發(fā)展高效的色譜技術(shù)被廣泛用于純化抗體藥物。本文依據(jù)二乙烯基砜容易發(fā)

6、生14Michaeladdition反應(yīng)的特點(diǎn)，制備得El乙烯基砜修飾的陰離子交換模板，并將該共聚物鍵合在硅膠表面；進(jìn)一步用于制備得到末端含有親水性Mannose冪I(OEG)4NH2基團(tuán)的硅膠固定相材料(Si02DVSM)。通過元素分析、固體核磁和紅外方法檢測了材料表面的物理性質(zhì)。Zeta電勢分析顯示了該材料對(duì)pH的敏感性，在pH250到800之間，我們測定了材料結(jié)合IgG的容量。在親水模式下，Si02DVSM材料能夠高效分離單糖和多