親和色譜材料的制備及在糖蛋白-糖肽分離分析中的應用研究.pdf

1、博士學位論文親和色譜材料的制備及在糖蛋白／糖肽分離分析中的應用研究Preparationofaffinitychromatographicmaterialsfortheseparationandanalysisofglycoproteins／glycopeptides學11l07100大連理工大學DalianUniversityofTechnology大連理工大學博士學位論文摘要糖基化修飾是最常見和最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，在真核生

2、物中，大約50％的蛋白質(zhì)發(fā)生了糖基化。糖基化參與了多種生命活動，包括細胞生長、發(fā)育生物學、細胞內(nèi)運輸、免疫反應和細胞間的交流等。文獻報道，異常糖基化和癌癥、人類免疫缺陷病毒和免疫失調(diào)等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可被應用于診斷和預測疾病及其病理的發(fā)展過程，需要發(fā)展分離糖蛋白糖肽的新型材料和開發(fā)相應的分離分析方法。本論文致力于發(fā)展簡單、經(jīng)濟和高效的方法制備以硅膠為基質(zhì)的親和固定相，并發(fā)展相應的色譜分離方法，用于富集和分離糖蛋白／糖肽。針對傳統(tǒng)

3、方法中制備親和固定相所存在的不耐高壓和材料親和容量低的問題，我們改用硅膠為基質(zhì)，在硅膠表面高效鍵合親水性的羧基官能團，經(jīng)過碳化二亞胺(EDC)矛IN羥基琥珀酰亞胺(NHS)的活化，鍵合了伴刀豆凝集素(ConA)，得到SGConA色譜固定相。相比較于商品化的以凝膠為基質(zhì)的凝集素材料AgaroseConA，SGConA色譜固定相在高效液相色譜模式下，能夠高效富集含有復合型聚糖的卵清蛋(了(ovalbumin)和含有高甘露糖型聚糖的核糖核酸酶

4、B(RNaseB)，表現(xiàn)出高效富集糖蛋白糖肽的特點，以及在蛋白質(zhì)組學分析中的應用潛力。傳統(tǒng)的方法制備凝集素材料，存在非特異性吸附的缺點。因此，本文使用氧化葡聚糖為間隔臂，合成了一種以硅膠為基質(zhì)的ConA材料(Si02ODexConA)用于富集糖蛋白／糖肽。為了比較，我們同時按照傳統(tǒng)制備ConA固定相的方法，以環(huán)氧丙基硅烷為起始間隔臂，制備了另一種以硅膠為基質(zhì)的Si02AidConA材料。相比較于Si02AidConA材料，Si02ODe

5、xConA材料依靠氧化葡聚糖的柔韌性和親水性的優(yōu)勢，在吸附糖蛋白ovalbumin的過程中展現(xiàn)出較低的非特異性吸附和高結(jié)合容量的特點。在高效色譜模式下，Si02ODexConA材料可以高效富集高甘露糖型和雙天線復合型聚糖的糖蛋白／糖肽，并且Si02ODexConA材料可以用于從復雜樣品中選擇性的富集糖蛋白，體現(xiàn)出在蛋白質(zhì)組學應用中的潛力。目前，針對抗體藥物的日益增長需求，發(fā)展高效的色譜技術(shù)被廣泛用于純化抗體藥物。本文依據(jù)二乙烯基砜容易發(fā)

6、生14Michaeladdition反應的特點，制備得El乙烯基砜修飾的陰離子交換模板，并將該共聚物鍵合在硅膠表面；進一步用于制備得到末端含有親水性Mannose冪I(OEG)4NH2基團的硅膠固定相材料(Si02DVSM)。通過元素分析、固體核磁和紅外方法檢測了材料表面的物理性質(zhì)。Zeta電勢分析顯示了該材料對pH的敏感性，在pH250到800之間，我們測定了材料結(jié)合IgG的容量。在親水模式下，Si02DVSM材料能夠高效分離單糖和多