金屬螯合親和色譜填料的制備及其在六聚組氨酸融合蛋白分離中的應(yīng)用.pdf

1、近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，分離純化基因重組蛋白的下游技術(shù)越來越顯示出其重要性。從成分復(fù)雜的表達(dá)體系中分離純化目的蛋白是一項(xiàng)艱巨而繁重的任務(wù)。目前基于分子的尺寸、形狀、電荷、分子量、吸附等性質(zhì)的差異進(jìn)行蛋白質(zhì)分離的方法也已在蛋白質(zhì)純化中得到不同程度的應(yīng)用，而金屬螯合親和層析法(Metal Chelate Affinity Chromatographic，MCAC．又叫固定金屬離子親和層析法Immobilized Metal ion

2、Affinity Chromatography，IMAC)以其分辨率高、選擇性好、操作簡(jiǎn)單而成為一種重要的蛋白質(zhì)分離方法。研究表明，影響金屬螯合親和色譜分離效果的因素很多，如溶液的pH值、鹽濃度、洗脫方式等，但決定色譜填料分離效果的主要因素在于填料的基質(zhì)、配基及螯合金屬離子種類。瓊脂糖(Agarose)具有良好的親水性和穩(wěn)定性，與可溶性蛋白的非特異性反應(yīng)小。作為填料基質(zhì)既可在非變性條件下使用，又可在變性條件(如6 mol/L鹽酸胍或8m

3、ol/L尿素)下使用。本實(shí)驗(yàn)用瓊脂糖作為基質(zhì)，選用四配位，與金屬離子有較強(qiáng)作用力的羧甲基天冬氨酸為配基，以Co<'2+>、Ni<'2+>作為螯合金屬離子，合成了一系列金屬螫合親和色譜填料，并對(duì)其蛋白質(zhì)分離性能進(jìn)行了研究。論文主要工作為以下幾個(gè)方面： 1．以瓊脂糖(商品名SepharoseCl-6B)為基質(zhì)，環(huán)氧氯丙烷為交連劑，以羧甲基天冬氨酸(CM-Asp)為配基制備了分別螯合Co<'2+>和Ni<'2+>的兩種色譜介質(zhì)： Ag

4、arose—CM-Asp—Co、Agarose-CM-Asp—Ni。對(duì)瓊脂糖基質(zhì)和Agarose-CM-Asp—Co、 Agarose—CM—Asp—Ni的紅外光譜表征結(jié)果表明：Co<'2+>、Ni<'2+>已經(jīng)分別成功地螯合到被修飾的瓊脂糖微球上。瓊脂糖基質(zhì)與．Agarose—CM-Asp-Ni微球的電鏡照片對(duì)比結(jié)果顯示：介質(zhì)表面光滑，說明在實(shí)驗(yàn)過程中沒有引起微球形貌的變化，即在實(shí)驗(yàn)過程中沒有產(chǎn)生能引起非特異性吸附的因素。用這兩種介質(zhì)

5、對(duì)六聚組氨酸融合蛋白進(jìn)行了分離，對(duì)目標(biāo)蛋白的沈脫液做了SDS-PAGE分析，結(jié)果表明：兩者都取得了良好的分離效果，并且Agarose-CM-Asp-Co分離效果最佳。 2．以瓊脂糖為基質(zhì)，環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑，制備了一系列不同羧甲基天冬氨酸擔(dān)載量的介質(zhì)微球：Agarose—0.5CM—Asp、Agarose-CM-Asp、Agarose-2CM-Asp。對(duì)其進(jìn)行了滴定分析，測(cè)得各自的配基數(shù)目依次分別為：3.34×10<'-5>、3

6、.83×10<'-5>、4.14×10<'-5>mol/L。結(jié)果表明：雖然配基CM-Asp的加入量成倍增加，但瓊脂糖表面所能擔(dān)載的配基CM-Asp的量增幅不大，說明在本實(shí)驗(yàn)條件下配基CM-Asp的螯合量已基本飽和。對(duì)上述三種不同CM-Asp擔(dān)載量所制備螯合金屬離子樣品進(jìn)行濕法硝解，通過原子吸收測(cè)定金屬離子擔(dān)載量，其結(jié)果也支持了上述觀點(diǎn)。用上述三種不同CM-Asp擔(dān)載量的微球所制備的金屬離子Co<'2+>、Ni<'2+>螯合材料做六聚組氨

7、酸融合蛋白分離，結(jié)果顯示，金屬離子螯合量的變化只影響到色譜介質(zhì)的蛋白質(zhì)吸附量，而對(duì)分離純度沒有明顯影響。 3.優(yōu)化了對(duì)200μL細(xì)胞裂解液純化所需的Agarose-CM-Asp-Co的介質(zhì)用量、 Agarose-CM-Asp-Co與細(xì)胞裂解液的孵育時(shí)間、介質(zhì)的清洗條件、目標(biāo)蛋白洗脫時(shí)所需咪唑濃度等條件。比較了Agarose-CM-Asp-Co與Ni-NTA-Agarose(Qiagen公司產(chǎn)品)兩種螯合介質(zhì)對(duì)融合蛋白的純化效果。