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文檔簡介
1、目的:
構(gòu)建弓形蟲RH株p3×Flag-CMW-14-TgHSP70真核表達(dá)重組質(zhì)粒。觀察不同劑量的重組質(zhì)粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70皮下肌肉注射免疫BALB/c小鼠誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答動態(tài)變化。
方法:
第一部分:設(shè)計合成TgHSP70引物,PCR擴(kuò)增其基因片段,獲得弓形蟲速殖子熱休克蛋白(TgHSP70)基因編碼片段,雙酶切后與真核表達(dá)質(zhì)粒p3×Flag-CMW-14連接,連
2、接產(chǎn)物經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定。脂質(zhì)體法將重組體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞中,TgHSP70的表達(dá)產(chǎn)物通過RT-PCR和Western blot在基因和蛋白兩個水平進(jìn)行鑒定。
第二部分:125只BALB/c小鼠隨機(jī)均分5組,分別用50μg、100μg、150μg重組質(zhì)粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70/只皮下肌肉注射免疫小鼠3次,各間隔2周,空白對照組注射100μl Elution緩沖液,空質(zhì)粒組注射50μg p3
3、×Flag-CMW-14,重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒分別溶于100μl Elution緩沖液中。分別于首免后第2、4、6、8、10周摘眼球采血,分離血清,每組5只,ELISA法測定血清中IL-2、IFN-γ水平。頸椎脫臼處死小鼠,無菌取脾,分離脾淋巴細(xì)胞并計數(shù);再加入終濃度為5μg/ml的ConA,5%CO2、37℃培養(yǎng)24h、72h,取培養(yǎng)上清。ELISA法測定培養(yǎng)24h上清液中IL-4、IL-2水平和培養(yǎng)72h上清液中IFN-γ水平。
4、 結(jié)果:
PCR擴(kuò)增獲得約495 bp的HSP70編碼基因片段,p3×Flag-CMW-14-TgHSP70重組體構(gòu)建成功,陽性克隆經(jīng)雙酶切、PCR及測序鑒定,基因片段序列完全正確。將 p3×Flag-CMW-14-TgHSP70真核表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中,經(jīng)RT-PCR檢測可見預(yù)期大小的目的基因條帶,Western-blot檢測表達(dá)產(chǎn)物大小約19 kDa。
50μg、100μg、150
5、μg重組質(zhì)粒組小鼠血清IL-2水平在免疫后第6周明顯上升,第8周達(dá)到頂峰,第10周稍有回落。50μg、100μg、150μg重組質(zhì)粒組和對照組的血清IFN-γ水平隨時間改變基本一致,無明顯差異。免疫后第10周,50μg重組質(zhì)粒組脾細(xì)胞數(shù)(17.362x106個/ml)顯著高于150μg組(15.22x106個/ml)、lOOμg組(15.66x106個/ml)、空質(zhì)粒組(14.82x106個/ml)和空白對照組(16.076x106個/
6、ml)(F=4.478,P<0.05)。免疫后第2~10周150μg組脾淋巴細(xì)胞IL-4水平均高于50μg和100μg組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。免疫后第2~10周,50μg、100μg、150μg重組質(zhì)粒組和空質(zhì)粒組脾細(xì)胞IL-2水平均高于對照組,差異顯著(F=5.319,P<0.05),150μg重組質(zhì)粒組顯著高于其他各組。免疫后第2~10周,150μg重組質(zhì)粒組脾細(xì)胞IFN-γ水平顯著高于其它各組(F=3.918,P<0.05),并在
7、第8周(A405=0.9867)時達(dá)到最高值。
結(jié)論:
成功構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70。不同劑量重組質(zhì)粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70免疫小鼠均可誘導(dǎo)一定的細(xì)胞免疫應(yīng)答,150μg重組質(zhì)粒組誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞IL-2和IFN-γ水平優(yōu)于50μg、100μg重組質(zhì)粒組,50μg、100μg、150μg重組質(zhì)粒組在免疫后第8周誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答達(dá)到高峰。該重組質(zhì)粒
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