弓形蟲新疫苗候選分子編碼基因的篩選、質(zhì)粒構(gòu)建及保護(hù)性研究.pdf

1、目的:篩選新的弓形蟲病疫苗候選分子,構(gòu)建弓形蟲真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/T.g-R1,并觀察重組質(zhì)粒所誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答.方法:1、用感染弓形蟲的大鼠血清和正常大鼠血清免疫篩選弓形蟲速殖子cDNA文庫,對(duì)陽性克隆測(cè)序并進(jìn)行序列分析;2、通過各種數(shù)據(jù)庫和分析軟件對(duì)新基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能及細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè);3、采用PCR擴(kuò)增出T.g-R1目的基因,用EcoRⅠ/Xho Ⅰ分別對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3進(jìn)行雙酶切,將T.g-

2、R1定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ/Xho Ⅰ位點(diǎn);對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增、雙酶切初步鑒定后作序列測(cè)定;4、大量制備并提純重組質(zhì)粒pcDNA3/T.g-R1,肌肉注射法免疫小鼠;ELISA法檢測(cè)特異性抗體水平;PCR檢測(cè)肌肉組織DNA中T.g-R1基因;弓形蟲RH株速殖子攻擊感染免疫鼠,觀察其發(fā)病時(shí)間和存活時(shí)間.結(jié)果:1、通過篩選弓形蟲cDNA文庫,共獲得18個(gè)陽性克隆.經(jīng)序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)插入片段的大小在0.45kb-3.2kb之間,

3、查詢所有基因庫并經(jīng)ExPASy(Expert Protein Analysis System)軟件分析鑒定出10個(gè)新的基因,GenBank登錄號(hào)分別為AY180109、AY185205、AY186540、AY208749、AY207004、AY208944、AY208675、AY208748、AY186539和AY349162;2、對(duì)所有新基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,包括蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能及細(xì)胞表位的預(yù)測(cè);3、成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3/T

4、.g-R1,DNA序列測(cè)定結(jié)果表明將大小為405bp的T.g-R1片段定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ/Xho Ⅰ位點(diǎn);4、經(jīng)pcDNA3/T.g-R1免疫的小鼠血清中檢測(cè)到特異性抗體,以肌肉組織DNA為模板特異地?cái)U(kuò)增出T.g-R1基因,用弓形蟲強(qiáng)毒株速殖子攻擊感染各免疫組小鼠,pcDNA3/T.g-Ri免疫組的保護(hù)性與空質(zhì)粒對(duì)照組比較無明顯優(yōu)越性,但均明顯優(yōu)于生理鹽水對(duì)照組.結(jié)論:從弓形蟲cDNA文庫中分離出10個(gè)弓形蟲新基因并對(duì)其