弓形蟲P30-P22 DNA疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效應(yīng).pdf

1、弓形蟲病是一種廣泛存在于世界各地的人獸共患寄生蟲病。該病的人群感染率極為普遍，估計(jì)全世界至少有三分之一的人感染弓形蟲，成年人感染大多為陰性感染。弓形蟲是一種機(jī)會(huì)性致病原蟲，是器官移植、惡性腫瘤、艾滋病患者等免疫抑制或免疫缺陷者發(fā)生死亡的主要原因。孕婦感染弓形蟲后，蟲體可穿越胎盤屏障感染胎兒，影響其發(fā)育，嚴(yán)重者可導(dǎo)致畸胎、死胎、智力發(fā)育不全等后遺癥。此外，弓形蟲病也給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，為了有效的防治弓形蟲，疫苗的研制已成

2、為預(yù)防及治療弓形蟲病的發(fā)展方向。 近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，弓形蟲疫苗從最早的全蟲疫苗到新近迅速發(fā)展起來的核酸疫苗均取得了很大進(jìn)展，特別是核酸疫苗為弓形蟲疫苗的研制帶來了新的希望。弓形蟲速殖子表膜是宿主免疫防御系統(tǒng)識(shí)別并殺傷蟲體的主要作用靶位，含有5種主要表面抗原：P30，P22，P35，P23，P43。其中，P30(SAG1)抗原由于具有高度的免疫原性，能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫保護(hù)力，并且無蟲株特異性，是目前用基因

3、工程方法表達(dá)和研究最多的蟲體成分?？筆30抗體在體外有殺蟲作用，在體內(nèi)有保護(hù)作用。P30刺激機(jī)體產(chǎn)生IgG、IgM、IgA等抗體，并能誘導(dǎo)γ-干擾素和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生。而且，P30抗原特異性的CD4+T細(xì)胞能直接殺傷細(xì)胞外弓形蟲。P22抗原為速殖子膜表面的另一重要抗原，與弓形蟲入侵宿主細(xì)胞有密切的關(guān)系，到目前為止，對(duì)弓形蟲P22蛋白的功能研究較少，P22(SAG2)蛋白可以使弓形蟲固定于有核細(xì)胞的表面，并輔助弓形蟲進(jìn)入有核細(xì)胞，介

4、導(dǎo)弓形蟲速殖子的入侵過程。抗SAG2蛋白抗體也可以阻斷弓形蟲的再定位，還有可能在弓形蟲速殖子向緩殖子轉(zhuǎn)化的過程中起作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，把P30抗原和P22抗原聯(lián)合免疫小鼠，效果更為明顯。 本課題利用本教研室構(gòu)建的pcDNA3.1-P30-P22真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)堿裂解法大量制備，純化后用NS稀釋到濃度為1ug/ul，用肌肉注射和皮下注射兩種方法直接免疫BALB/c小鼠，初次免疫后分別于第2周和第4周各加強(qiáng)免疫一次，在末次免疫后的2、

5、4、6周對(duì)小鼠進(jìn)行斷尾取血，分離血清，用間接ELISA測(cè)定IgG抗體滴度及IgG亞型；分別于免疫后2、4、6周三次用雙抗夾心ELISA測(cè)定血清細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4的含量；免疫后4周和8周，分別取小鼠的注射部位肌肉、血液、肝臟和脾臟等部位抽提組織DNA，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析；無菌取脾，用MTT法測(cè)定小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和NK細(xì)胞殺傷率，用免疫熒光法對(duì)CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群進(jìn)行

6、測(cè)定；末次免疫6周后，用弓形蟲速殖子腹腔感染小白鼠，觀察小白鼠的存活時(shí)間。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組IgG抗體水平高于對(duì)照組，差異有顯著性，兩實(shí)驗(yàn)組IgG亞類以IgG2a為主；實(shí)驗(yàn)組IFN-γ、IL-2含量高于對(duì)照組，且隨著免疫時(shí)間的延長有增高趨勢(shì)，而IL-4在各組均未檢出；攻擊感染后實(shí)驗(yàn)組存活時(shí)間延長；實(shí)驗(yàn)組NK細(xì)胞殺傷率比對(duì)照組明顯增高，差異有顯著性；ConA刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，各組脾臟細(xì)胞均有增殖，但實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異無顯著性；對(duì)T淋巴細(xì)

7、胞亞群進(jìn)行分析，可見隨著時(shí)間延長，CD8+的數(shù)量上升，CD4+/CD8+的比率下降，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著性差異；免疫后4周，免疫組小鼠的上述組織均擴(kuò)增出P30-P22基因片斷，對(duì)照組均未擴(kuò)增出相應(yīng)片斷；免疫后8周，各組織均未擴(kuò)增出上述特異性片斷。 本研究顯示，弓形蟲表面抗原P30-P22復(fù)合DNA疫苗免疫BALB/c小鼠可誘導(dǎo)一定的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)攻擊感染具有一定的保護(hù)性。為今后弓形蟲疫苗的研制和應(yīng)用提供一定的理論