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文檔簡介
1、弓形蟲病是一種廣泛存在于世界各地的人獸共患寄生蟲病。該病的人群感染率極為普遍,估計全世界至少有三分之一的人感染弓形蟲,成年人感染大多為陰性感染。弓形蟲是一種機會性致病原蟲,是器官移植、惡性腫瘤、艾滋病患者等免疫抑制或免疫缺陷者發(fā)生死亡的主要原因。孕婦感染弓形蟲后,蟲體可穿越胎盤屏障感染胎兒,影響其發(fā)育,嚴重者可導(dǎo)致畸胎、死胎、智力發(fā)育不全等后遺癥。此外,弓形蟲病也給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失。因此,為了有效的防治弓形蟲,疫苗的研制已成
2、為預(yù)防及治療弓形蟲病的發(fā)展方向。 近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,弓形蟲疫苗從最早的全蟲疫苗到新近迅速發(fā)展起來的核酸疫苗均取得了很大進展,特別是核酸疫苗為弓形蟲疫苗的研制帶來了新的希望。弓形蟲速殖子表膜是宿主免疫防御系統(tǒng)識別并殺傷蟲體的主要作用靶位,含有5種主要表面抗原:P30,P22,P35,P23,P43。其中,P30(SAG1)抗原由于具有高度的免疫原性,能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較強的免疫保護力,并且無蟲株特異性,是目前用基因
3、工程方法表達和研究最多的蟲體成分??筆30抗體在體外有殺蟲作用,在體內(nèi)有保護作用。P30刺激機體產(chǎn)生IgG、IgM、IgA等抗體,并能誘導(dǎo)γ-干擾素和細胞毒性淋巴細胞的產(chǎn)生。而且,P30抗原特異性的CD4+T細胞能直接殺傷細胞外弓形蟲。P22抗原為速殖子膜表面的另一重要抗原,與弓形蟲入侵宿主細胞有密切的關(guān)系,到目前為止,對弓形蟲P22蛋白的功能研究較少,P22(SAG2)蛋白可以使弓形蟲固定于有核細胞的表面,并輔助弓形蟲進入有核細胞,介
4、導(dǎo)弓形蟲速殖子的入侵過程??筍AG2蛋白抗體也可以阻斷弓形蟲的再定位,還有可能在弓形蟲速殖子向緩殖子轉(zhuǎn)化的過程中起作用。有文獻報道,把P30抗原和P22抗原聯(lián)合免疫小鼠,效果更為明顯。 本課題利用本教研室構(gòu)建的pcDNA3.1-P30-P22真核表達質(zhì)粒,經(jīng)堿裂解法大量制備,純化后用NS稀釋到濃度為1ug/ul,用肌肉注射和皮下注射兩種方法直接免疫BALB/c小鼠,初次免疫后分別于第2周和第4周各加強免疫一次,在末次免疫后的2、
5、4、6周對小鼠進行斷尾取血,分離血清,用間接ELISA測定IgG抗體滴度及IgG亞型;分別于免疫后2、4、6周三次用雙抗夾心ELISA測定血清細胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4的含量;免疫后4周和8周,分別取小鼠的注射部位肌肉、血液、肝臟和脾臟等部位抽提組織DNA,并以此為模板進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析;無菌取脾,用MTT法測定小鼠脾臟T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率和NK細胞殺傷率,用免疫熒光法對CD4+、CD8+T細胞亞群進行
6、測定;末次免疫6周后,用弓形蟲速殖子腹腔感染小白鼠,觀察小白鼠的存活時間。結(jié)果顯示,實驗組IgG抗體水平高于對照組,差異有顯著性,兩實驗組IgG亞類以IgG2a為主;實驗組IFN-γ、IL-2含量高于對照組,且隨著免疫時間的延長有增高趨勢,而IL-4在各組均未檢出;攻擊感染后實驗組存活時間延長;實驗組NK細胞殺傷率比對照組明顯增高,差異有顯著性;ConA刺激淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗,各組脾臟細胞均有增殖,但實驗組與對照組差異無顯著性;對T淋巴細
7、胞亞群進行分析,可見隨著時間延長,CD8+的數(shù)量上升,CD4+/CD8+的比率下降,實驗組與對照組有顯著性差異;免疫后4周,免疫組小鼠的上述組織均擴增出P30-P22基因片斷,對照組均未擴增出相應(yīng)片斷;免疫后8周,各組織均未擴增出上述特異性片斷。 本研究顯示,弓形蟲表面抗原P30-P22復(fù)合DNA疫苗免疫BALB/c小鼠可誘導(dǎo)一定的體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答,對攻擊感染具有一定的保護性。為今后弓形蟲疫苗的研制和應(yīng)用提供一定的理論
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